Verminderte Anfälligkeit von Plasmodium falciparum gegenüber Dihydroartemisinin und Lumefantrin in Norduganda

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6353 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine partielle Artemisinin-Resistenz kann die Auswahl von Plasmodium falciparum erleichtern, das gegenüber Arzneimitteln von Kombinationstherapiepartnern resistent ist. Wir haben 99 P. falciparum-Isolate ausgewertet, die im Jahr 2021 aus Norduganda, wo resistente PfK13-C469Y- und A675V-Mutationen aufgetreten sind, und Ostuganda, wo diese Mutationen selten vorkommen, gesammelt wurden. Mit dem Ex-vivo-Ringüberlebenstest hatten Isolate mit der 469Y-Mutation (mittleres Überleben 7,3 % für Mutanten, 2,5 % gemischt und 1,4 % Wildtyp) und/oder Mutationen in Pfcoronin oder Falcipain-2a eine signifikant längere Überlebensrate; Alle Isolate mit einer Überlebensrate von >5 % wiesen Mutationen in mindestens einem dieser Proteine auf. Mit Ex-vivo-Wachstumshemmungstests war die Empfindlichkeit gegenüber Lumefantrin (mittlerer IC50 14,6 vs. 6,9 nM, p < 0,0001) und Dihydroartemisinin (2,3 vs. 1,5 nM, p = 0,003) im nördlichen vs. östlichen Uganda verringert; 14/49 nördliche vs. 0/38 östliche Isolate hatten Lumefantrin-IC50 > 20 nM (p = 0,0002). Durch die gezielte Sequenzierung von 819 Isolaten aus den Jahren 2015–21 wurden mehrere Polymorphismen identifiziert, die mit einer veränderten Arzneimittelanfälligkeit verbunden sind, insbesondere PfK13 469Y mit verringerter Anfälligkeit für Lumefantrin (p = 6 × 10–8) und PfCRT-Mutationen mit Chloroquinresistenz (p = 1 × 10–20). . Unsere Ergebnisse geben Anlass zur Sorge hinsichtlich der Aktivität von Artemether-Lumefantrin, dem Mittel der ersten Wahl gegen Malaria in Uganda.

Arzneimittelresistenzen stellen seit Jahrzehnten eine Herausforderung für die Behandlung und Kontrolle der Falciparum-Malaria dar1. Vor etwa 15 Jahren wurde in Südostasien eine teilweise Resistenz gegen Artemisinine festgestellt, die derzeit wichtigsten Medikamente zur Behandlung von Malaria.2,3 Der Phänotyp der partiellen Resistenz führt zu einer verzögerten Clearance von Parasiten nach der Behandlung von Patienten mit Artemisininen4 oder zu einem verbesserten Überleben kultivierter Parasiten nach Exposition gegenüber Dihydroartemisinin (DHA)5. Es wurde gezeigt, dass eine teilweise Resistenz in Südostasien mit etwa 20 möglichen oder validierten Mutationen in der Propellerdomäne des P. falciparum Kelch 13 (PfK13)-Proteins verbunden ist6,7. Zusätzliche Polymorphismen gingen mit PfK13-Mutationen bei Artemisinin-resistenten südostasiatischen Parasiten einher,8,9 und die In-vitro-Selektion afrikanischer Parasiten mit DHA führte zu einer verzögerten Clearance im Zusammenhang mit Mutationen im P. falciparum-Coronin (Pfcoronin)10. PfK13-Mutationen, die in Südostasien als Resistenzmediatoren validiert wurden, wurden in einigen anderen Teilen der Welt gemeldet11,12,13, aber bis vor kurzem fehlten Beweise für eine anhaltende Prävalenz dieser Mutationen oder eine dokumentierte klinische oder In-vitro-Resistenz14. Die größte Sorge bereitet die mögliche Entstehung oder Ausbreitung von Resistenzen in Afrika, wo der Großteil der Malaria-Morbidität und -Mortalität auftritt15. Kürzlich wurden in Ostafrika PfK13-Mutationen beschrieben, die zuvor mit einer partiellen Artemisinin-Resistenz in Asien in Verbindung gebracht wurden, wobei die PfK13-R561H-Mutation in Ruanda16,17,18 und die C469Y- und A675V-Mutationen in Norduganda auftraten19,20,21,22. In begrenzten Studien wurde gezeigt, dass die Mutationen C469Y, R561H und A675V mit einer partiellen Artemisinin-Resistenz assoziiert sind, die klinisch (verzögerte Clearance) oder in vitro (verlängertes Überleben) gemessen wurde17,22, aber unser Verständnis der Auswirkungen des kürzlich aufgetretenen P. falciparum Mutationen zur Arzneimittelsensitivität und zur Behandlungswirksamkeit führender Artemisinin-basierter Kombinationstherapien (ACTs) in Afrika sind unvollständig.

ACTs kombinieren ein schnell wirkendes Artemisinin mit einem langsamer wirkenden Partnerarzneimittel23. In Südostasien folgte auf das Auftreten einer partiellen Resistenz gegen Artemisinin Hinweise auf eine verminderte Antimalariaaktivität der ACT-Partnermedikamente Mefloquin24 und Piperaquin25. Insbesondere die Resistenz gegen Artemisinine, die hauptsächlich mit der PfK13-580Y-Mutation in Zusammenhang steht, und gegen Piperaquin, die mit neuen Mutationen in der PfCRT- und Plasmepsin-2/3-Genamplifikation in Zusammenhang steht, führte in Kambodscha zu Ausfallraten bei DHA-Piperaquin von >50 %26,27,28. Das jüngste Auftreten einer teilweisen Resistenz gegen Artemisinine in Ostafrika könnte in ähnlicher Weise zur Selektion von Parasiten mit verminderter Empfindlichkeit gegenüber ACT-Partnermedikamenten führen. Angesichts der massiven Malaria-Zahlen in Afrika könnte diese Konsequenz verheerende Folgen haben, wie das Aufkommen der Chloroquin-Resistenz in den 1980er Jahren zeigte, die zu Millionen von Todesfällen durch Malaria führte29.

Die in Afrika am häufigsten eingesetzte ACT zur Behandlung von Malaria ist Artemether-Lumefantrin. Im Gegensatz zu den meisten Malariamitteln ist Lumefantrin nicht als Monotherapie erhältlich, sondern wird nur in Kombination mit Artemether verabreicht. Vielleicht aus diesem Grund wurde die Resistenz von P. falciparum gegen Lumefantrin bei im Feld isolierten Parasiten nicht eindeutig identifiziert. Durch Langzeitinkubation mit dem Arzneimittel in vitro wurde jedoch ein instabiler Lumefantrin-Resistenz-Phänotyp ausgewählt30, und in Studien an Feldisolaten wurden Schwankungen in der Anfälligkeit gegenüber Lumefantrin beobachtet. Die Anfälligkeit für Lumefantrin wurde mit Polymorphismen in PfMDR1, einem mutmaßlichen Arzneimitteltransporter, in Verbindung gebracht. Die Mutation PfMDR1 86Y wurde durch den Einsatz von Amodiaquin selektiert, dagegen durch Therapie mit Artemether-Lumefantrin selektiert und ist in den letzten Jahren in den meisten Teilen Afrikas15, einschließlich Uganda20, auf eine sehr niedrige Prävalenz zurückgegangen. Der Wildtyp-PfMDR1-N86-Genotyp ist mit einer geringeren Ex-vivo-Lumefantrin-Empfindlichkeit im Vergleich zu 86Y-Mutantenparasiten verbunden31,32 und wurde in einer Analyse von Daten aus 31 klinischen Studien33 mit einem Behandlungsversagen in Verbindung gebracht, aber die mit diesem Allel verbundenen Veränderungen der Empfindlichkeit waren bescheiden . Auch die Lumefantrin-Empfindlichkeit wird durch die Amplifikation des pfmdr1-Gens verringert34,35, aber dieser Polymorphismus war bei untersuchten afrikanischen Parasiten sehr selten15. In Uganda nahm die Anfälligkeit für Lumefantrin in Verbindung mit dem Verlust der PfMDR1-86Y-Mutation im Laufe der Zeit geringfügig ab31,32,36,37, die relative klinische Wirksamkeit von Artemether-Lumefantrin im Vergleich zu Artesunat-Amodiaquin nahm im Laufe der Zeit ab38 und eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte eine Korrektur Behandlungswirksamkeit von Artemether-Lumefantrin an einer Stelle unter 90 %39. Obwohl die In-vitro-Aktivität von Lumefantrin und die klinische Wirksamkeit von Artemether-Lumefantrin insgesamt gut geblieben sind, gibt es Hinweise darauf, dass die Aktivität möglicherweise abnimmt.

Das jüngste Auftreten von Artemisinin-resistentem P. falciparum in Norduganda gibt Anlass zur Sorge, dass eine Resistenz gegen ACT-Partnermedikamente folgen könnte, wie dies in Südostasien der Fall ist. Um diese Möglichkeit zu untersuchen und die Artemisinin-Partialresistenz in Uganda besser zu charakterisieren, verglichen wir die Genotypen und Phänotypen von Parasiten, die in Norduganda, wo in den letzten Jahren die Mutationen PfK13 469Y und 675V aufgetreten sind, gesammelt wurden, mit Ostuganda, wo wir seit über 20 Jahren klinische Isolate untersuchen ein Jahrzehnt, und Marker der Artemisinin-Resistenz waren ungewöhnlich. Darüber hinaus analysierten wir eine größere Bank phänotypisierter Isolate aus Ostuganda, um genetische Korrelate von Phänotypen der Arzneimittelanfälligkeit besser zu untersuchen.

Um Isolate aus verschiedenen Teilen des Landes zu vergleichen, bewerteten wir Genotypen, Wachstumshemmung und Ringüberleben für Isolate, die von Patienten mit unkomplizierter Falciparum-Malaria im Patongo Health Center III, Agogo District, im Norden Ugandas (n = 57) und Tororo gesammelt wurden District Hospital, Tororo District und Busiu Health Center IV, Mbale District, zwei nahegelegene Standorte im Osten Ugandas (n = 42), vom 31. Mai bis 16. August 2021 (Abb. 1). Die Merkmale der Teilnehmer, die diese Proben zur Verfügung stellten, sowie die Merkmale ihrer Infektionen sind in Tabelle 1 beschrieben. In einer umfassenderen Umfrage untersuchten wir die Genotypen und Wachstumshemmung für Isolate von 819 Patienten mit unkomplizierter Falciparum-Malaria, einschließlich der oben genannten Standorte und des Masafu Hospital, Busia Bezirk, vom 9. Dezember 2015 bis 20. August 2021 (Tabelle 1). Drogenanfälligkeiten für die Proben aus Ostuganda bis 2019 wurden bereits zuvor veröffentlicht32; In diesem Bericht konzentrieren wir uns auf Zusammenhänge zwischen der detaillierten Sequenzierung potenzieller Resistenzmediatoren und den Phänotypen der Arzneimittelanfälligkeit.

Studienorte sind gekennzeichnet. Die kombinierte Prävalenz der Mutationen PfK13 469Y und 675V in Bezirken mit verfügbaren Überwachungsdaten aus dem Jahr 201921 wird mit der Farbskala dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Für Isolate, die 2021 gleichzeitig in Nord- und Ostuganda gesammelt wurden, verwendeten wir molekulare Inversionssondentests (MIP), um Sequenzen von 80 Genen zu charakterisieren, die möglicherweise Arzneimittelresistenz vermitteln (Ergänzungstabelle 1). Von besonderem Interesse waren Parasitenpolymorphismen, die kürzlich mit einer veränderten Empfindlichkeit gegenüber Komponenten von ACTs in Verbindung gebracht wurden, nämlich Mutationen der PfK13-Propellerdomäne, die mit einer teilweisen Resistenz gegen Artemisinine verbunden sind, und Polymorphismen, die mit einer veränderten Empfindlichkeit gegenüber Lumefantrin (pfmdr1-Amplifikation und Mutationen) und Piperaquin (Plasmepsin-2/3-Amplifikation) verbunden sind und neuartige PfCRT-Mutationen). In Übereinstimmung mit aktuellen Daten waren die Prävalenzen der PfK13-C469Y- und A675V-Mutationen im Norden Ugandas höher als im Osten Ugandas (C469Y 34 % vs. 3 %, p < 0,001; A675V 13 % vs. 3 %, p = 0,06, Tabelle 2). . Andere Mutationen der PfK13-Propellerdomäne waren selten; Es wurden 15 Mutationen stromaufwärts der Propellerdomäne identifiziert. Weder eine Amplifikation der pfmdr1- oder Plasmepsin-2/3-Gene noch PfCRT-Mutationen, die mit einer Piperaquin-Resistenz in Asien assoziiert sind (T93S, H97Y, F145I, I218F, M343L, G353V), wurden beobachtet. In Anbetracht anderer gut beschriebener Polymorphismen, die zuvor mit Arzneimittelresistenzen in Verbindung gebracht wurden, waren die Prävalenzen von Mutationen in den Transportern PfCRT (K76T) und PfMDR1 (N86Y, D1246Y), die mit einer veränderten Empfindlichkeit gegenüber Aminochinolinen verbunden sind, sehr gering, die Prävalenzen von fünf Mutationen in PfDHFR (N51I, C59R, S108N) und PfDHPS (A437G, K540E), die mit einer Resistenz gegen die Antifolate Pyrimethamin und Sulfadoxin verbunden sind, waren sehr hoch, und zusätzliche Mutationen in PfDHFR (I164L) und PfDHPS (A581G), die mit einer hohen Antifolatresistenz verbunden sind, wurden alle mit geringer Prävalenz beobachtet im Einklang mit aktuellen Daten aus Uganda (Tabelle 2)20,21.

Anfälligkeiten gegenüber Lumefantrin (A Wachstumshemmungstest) und DHA (B RSA) bei Parasiten aus Nord- und Ostuganda. Jeder Punkt repräsentiert das Ergebnis für ein einzelnes Isolat (A n = 49 für Nord- und 38 für Ostuganda; B n = 52 für Nord- und 29 für Ostuganda). Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests bestimmt. Die mittleren Grenzen der Kästchen entsprechen dem Median und die minimalen und maximalen Grenzen entsprechen dem 25. bzw. 75. Perzentil. Whiskers erstrecken sich bis zu Extremwerten, die nicht mehr als das 1,5-fache des IQR vom 25. oder 75. Perzentil betragen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Für die mit dem Ring Survival Assay (RSA) untersuchten Isolate aus dem Jahr 2021 wurden die Proben bei 4 °C gelagert und am Tag der Entnahme in unser Labor in Tororo transportiert. Die Lagerungszeit vor Beginn der Kultur war für Proben, die im Norden Ugandas im Vergleich zum Osten Ugandas gesammelt wurden, etwas länger (Median 25,0 Stunden im Norden gegenüber 24,0 Stunden im Osten Ugandas, p = 0,001). Die Empfindlichkeit gegenüber einer Gruppe von sieben Antimalariamitteln wurde mit einem Standard-Wachstumshemmungstest (IC50) und für DHA mit dem Ex-vivo-RSA untersucht. In den beiden Regionen des Landes gesammelte Parasitentests wurden parallel durchgeführt. Die Empfindlichkeiten gegenüber Chloroquin, Desethylamodiaquin (dem aktiven Metaboliten von Amodiaquin), Piperaquin, Mefloquin und Pyronaridin waren an beiden Standorten ähnlich, und für jedes dieser Arzneimittel lagen die IC50-Werte auf Werten, die allgemein als sehr anfällig gelten (Tabelle 3). Im Gegensatz dazu waren Isolate aus Norduganda (nach Bonferroni-Korrektur) deutlich weniger anfällig für Lumefantrin und DHA als solche aus Ostuganda (Lumefantrin IC50 14,6 vs. 6,9 nM, p < 0,0001; Dihydroartemisinin IC50 2,3 vs. 1,5 nM, p = 0,003). ; Tisch 3). Für Lumefantrin hatten 14 von 49 Isolaten aus Norduganda, aber keines von 38 aus Ostuganda einen IC50 von >20 nM (p = 0,0002; Abb. 2). RSAs, bei denen die Parasiten 72 Stunden nach Beginn eines 6-stündigen DHA-Pulses gezählt wurden, zeigten keine signifikanten Unterschiede im Überleben zwischen Isolaten aus dem Norden (mittlere Überlebensrate von 2,5 % für 52 Proben) und den Isolaten aus dem Osten (mittlere Überlebensrate von 1,4 % für 29 Proben; p =). 0,53) Uganda, aber bemerkenswerterweise waren an beiden Standorten einige Parasiten mit PfK13-Mutationen vorhanden, die mit einer verzögerten Parasitenbeseitigung einhergingen (Abb. 2).

In den 81 Proben aus dem Jahr 2021 mit verfügbaren RSA-Daten suchten wir nach Zusammenhängen zwischen Ringüberleben und PfK13-Genotypen. Isolate mit der PfK13-469Y-Mutation hatten eine deutlich höhere Überlebensrate, wobei die Überlebensrate bei reinen Mutanten (durchschnittlich 7,3 %) im Vergleich zu gemischten (2,5 %) und reinen Wildtyp-Parasiten (1,4 %) am höchsten war (Abb. 3). Die PfK13-675-V-Mutation war nicht mit einer erhöhten Überlebensrate verbunden, diese Analyse war jedoch durch die Probengröße begrenzt, da nur zwei reine mutierte 675-V-Isolate für die Untersuchung zur Verfügung standen. Für eine umfassendere Betrachtung möglicher Resistenzdeterminanten verwendeten wir Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests, um nach Zusammenhängen zwischen Polymorphismen in 23 Genen zu suchen, deren Varianten mit der Artemisinin-Partialresistenz und unseren RSA-Ergebnissen in Verbindung gebracht wurden (Ergänzungstabelle 1). Ungewöhnliche Polymorphismen wurden als Aggregatvariablen bewertet, wie unter „Methoden“ beschrieben. Polymorphismen in fünf Genen waren im Vergleich zum Wildtyp mit einem verringerten oder erhöhten Ringüberleben verbunden (Ergänzungstabelle 2). Von diesen Genen, wenn man das häufiger vorkommende Allel (Hauptallel) als Wildtyp und das Nebenallel als Mutante betrachtet, gibt es eine von 8 Mutationen in Pfcoronin (Überleben 6,5 % bei der Mutante vs. 2,3 % im Wildtyp, p = 0,04) oder eine davon 17 Mutationen in Falcipain 2a (Überleben 3,2 % bei der Mutante vs. 0,6 % beim Wildtyp, p = 0,02) waren entweder allein oder in Verbindung mit PfK13-Mutationen am stärksten mit einem erhöhten Ringüberleben verbunden (Abb. 4). Unter Berücksichtigung der kombinierten Auswirkungen ist das Vorhandensein von PfK13 469Y plus einer Mutation in Pfcoronin (mittleres Überleben 12,6 % im Doppelmutanten vs. 1,4 % im Doppel-Wildtyp, p = 0,009) oder Falcipain-2a (mittleres Überleben 3,9 % im Doppelmutanten vs. 0 % im Doppel-Wildtyp, p = 0,004) war ebenfalls mit einer erhöhten Überlebensrate verbunden. Bemerkenswert ist, dass einige Isolate mit Wildtyp-PfK13-Sequenz zwar ein hohes Ringüberleben aufwiesen, diese Ausreißer jedoch offenbar durch Mutationen in Falcipain-2a erklärt werden konnten; Alle Isolate mit einer Ringüberlebensrate von >5 % wiesen entweder die PfK13-469Y-Mutation, Mutationen in Falcipain-2a oder beides auf. Interessanterweise waren Mutationen in PfK13 außerhalb der Propellerdomäne mit einem verringerten RSA-Überleben verbunden (das Gegenteil der Wirkung von PfK13 469Y); Unter Berücksichtigung einer der 15 identifizierten Nicht-Propeller-Mutationen betrug die Überlebensrate 1,5 % bei 42 Mutanten gegenüber 5,5 % bei 26 vollständig wildtypischen Isolaten (p = 0,02; Ergänzungstabelle 2). Zwei weitere Polymorphismen mit signifikanten unabhängigen Assoziationen waren die Deletion in einer mutmaßlichen Ubiquitin-Carboxyl-terminalen Hydrolase 1, die mit einem erhöhten RSA-Überleben verbunden war, und ein SNP in einem Gen, das für ein Protein unbekannter Funktion kodierte, das mit einem verringerten Überleben verbunden war.

Jeder Punkt stellt das Ergebnis für ein einzelnes Isolat dar (A n = 50 WT, 18 C469Y, 6 A675V; B n = 50 WT, 8 C469Y, 10 469Y, 4 A675V, 2 675V). Die Ergebnisse werden mit gemischten und reinen mutierten Isolaten kombiniert (A) oder separat (B) angezeigt. Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests bestimmt. Die mittleren Grenzen der Kästchen entsprechen dem Median und die minimalen und maximalen Grenzen entsprechen dem 25. bzw. 75. Perzentil. Whiskers erstrecken sich bis zu Extremwerten, die nicht mehr als das 1,5-fache des IQR vom 25. oder 75. Perzentil betragen. WT, Wildtyp. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anfälligkeiten gegenüber DHA durch RSA bei Parasiten mit unterschiedlichen PfK13-, Pfcoronin- (CRN; A, B) und Falcipain-2a- (FP2a; C, D) Genotypen werden gezeigt. Jeder Punkt stellt das Ergebnis für ein einzelnes Isolat dar (A n = 38 WT, 18 Mut; B n = 26 C469 + CRN-WT, 9 C469 + CRN-Mut, 12 469Y + CRN-WT, 5 469Y + CRN-Mut; C n = 17 WT, 47 Mut; D n = 11 C469 + FP2a-WT, 30 C469 + FP2a-Mut, 3 469Y + FP2a -WT, 15 469Y + FP2a-Mut). PfK13-Genotypen am Codon 469 sind angegeben; Die Mutante 469Y umfasst gemischte Isolate. Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests bestimmt. Die mittleren Grenzen der Kästchen entsprechen dem Median und die minimalen und maximalen Grenzen entsprechen dem 25. bzw. 75. Perzentil. Whiskers erstrecken sich bis zu Extremwerten, die nicht mehr als das 1,5-fache des IQR vom 25. oder 75. Perzentil betragen. WT, Wildtyp, Mut, jeder Pfcoronin- oder Falcipain-2a-Polymorphismus. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Beim Vergleich der Ergebnisse für Proben, die 2021 aus Nord- und Ostuganda gesammelt wurden, waren Isolate mit der Mutation PfK13 469Y oder 675 V deutlich weniger anfällig für Lumefantrin (IC50 14,1 nM für gemischtes oder mutiertes 469Y, 14,7 nM für gemischtes oder mutiertes 675 V und 8,7 nM). für Wildtyp; Abb. 5). Die Empfindlichkeiten gegenüber den anderen getesteten Arzneimitteln, einschließlich Mefloquin, das offenbar einige Determinanten einer verminderten Aktivität mit Lumefantrin teilt15, unterschied sich zwischen Wildtyp- und PfK13-mutierten Parasiten nicht.

Jeder Punkt stellt das Ergebnis für ein einzelnes Isolat dar (A n = 61 WT, 17 C469Y, 6 A675V; B n = 61 WT, 7 C469Y, 10 469Y, 5 A675V, 1 675V). Die Ergebnisse werden mit gemischten und reinen mutierten Isolaten kombiniert (A) oder separat (B) angezeigt. Die P-Werte wurden mithilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests bestimmt. Die mittleren Grenzen der Kästchen entsprechen dem Median und die minimalen und maximalen Grenzen entsprechen dem 25. bzw. 75. Perzentil. Whiskers erstrecken sich bis zu Extremwerten, die nicht mehr als das 1,5-fache des IQR vom 25. oder 75. Perzentil betragen. WT, Wildtyp. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Zusammenhänge zwischen Phänotypen und Genotypen umfassender zu betrachten, verwendeten wir einen großen Satz von 819 Isolaten mit Wachstumshemmungsdaten, die hauptsächlich aus Ostuganda im Zeitraum 2015–2021 gesammelt wurden, und umfassten auch 49 Proben, die im Jahr 2021 in Norduganda gesammelt wurden, wie oben beschrieben. Die Parasiten-DNA wurde mithilfe der MIP-Plattform genotypisiert, die auf 80 Gene abzielte, die für Proteine kodieren, die möglicherweise mit der Arzneimittelanfälligkeit in Verbindung stehen, einschließlich Proteinen, von denen bekannt ist oder vorhergesagt wird, dass sie Arzneimitteltransporter sind, und Proteinen, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass Polymorphismen zur Resistenz gegen etablierte Antimalariamittel und in der Entwicklung befindliche Verbindungen beitragen (Ergänzung). Tabelle 1). Wir identifizierten insgesamt 4337 Polymorphismen und verwendeten Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests, um Zusammenhänge zwischen der Variation in Ex-vivo-IC50s und dem Vorhandensein dieser Polymorphismen zu untersuchen.

Wir haben uns zunächst auf Lumefantrin konzentriert, da wir, wie oben beschrieben, signifikante Unterschiede in der Anfälligkeit in Proben aus Nord- und Ostuganda festgestellt haben. Bei der Auswertung von 713 Isolaten identifizierten wir 33 nicht-synonyme Polymorphismen, die mit Lumefantrin IC50 assoziiert sind, mit einer Signifikanz bei p ≤ 0,01. Wir haben dann gefiltert, um nur Loci einzuschließen, bei denen die mittleren IC50-Werte für gemischte und mutierte Allele in die gleiche Richtung tendierten (beide hatten im Vergleich zu Parasiten mit reinen Wildtyp-Genotypen eine erhöhte oder verringerte Arzneimittelempfindlichkeit) und bei denen das reine Minderheitsallel in mindestens einem vorhanden war Probe. Dies führte zur Identifizierung von Polymorphismen in 9 Genen, die mit einer veränderten Anfälligkeit für Lumefantrin verbunden sind (Tabelle 4). Vor allem die in Norduganda aufgetretenen PfK13-Mutationen waren stark mit einer verringerten Anfälligkeit für Lumefantrin verbunden (469Y, p = 6 × 10−8; 675 V p = 0,001). Weitere Assoziationen mit entweder erhöhter oder verringerter Anfälligkeit für Lumefantrin waren SNPs in PfMDR1, einschließlich der 86Y-Mutation, die mittlerweile sehr selten vorkommt, aber früher mit einer erhöhten Anfälligkeit für Lumefantrin in Verbindung gebracht wurde; und Polymorphismen in einer mutmaßlichen Phospholipase; der ApiAP2-Transkriptionsfaktor; die Multiresistenzproteine PfMRP1 und PfMRP2; und die Hämoglobinasen Falcipain-2a, Falcipain-3 und Plasmepsin I (Tabelle 4).

Unter Berücksichtigung der anderen sechs getesteten Arzneimittel wurden unter Anwendung der gleichen Filterkriterien wie für Lumefantrin Zusammenhänge zwischen einer Vielzahl von Polymorphismen und der Arzneimittelanfälligkeit festgestellt, meist mit relativ niedrigem Signifikanzniveau (Ergänzungstabellen 3–8). Am auffälligsten war, dass ein starker Zusammenhang zwischen gut charakterisierten Mutationen in PfCRT, einschließlich der K76T-Mutation, von der bekannt ist, dass sie Chloroquinresistenz vermittelt, und der Anfälligkeit gegenüber Chloroquin (p = 10−7−10−20 für 6 PfCRT-Mutationen) und dem verwandten Medikament Monodesethylamodiaquin (S = 0,01–0,0003 für 4 PfCRT-Mutationen). Diese Ergebnisse wurden erwartet15 und sie unterstützen die allgemeine Gültigkeit unserer Analysen.

Anekdotischerweise haben sich einige bemerkenswerte Ex-vivo-Phänotypen der Arzneimittelanfälligkeit als instabil erwiesen, wobei die IC50-Werte für Malariamedikamente nach der Kulturadaption niedriger waren als die unmittelbar nach der Probenentnahme beobachteten Werte, was möglicherweise durch ein erfolgreicheres Wachstum arzneimittelempfindlicher Stämme im Vergleich zu arzneimittelresistenten Stämmen in Mischkulturen erklärt werden kann . Um die Stabilität der beobachteten Phänotypen zu untersuchen, haben wir kulturadaptierte Stämme aus Norduganda mit bemerkenswerten Lumefantrin-IC50-Ergebnissen kultiviert. Die Anfälligkeit für Lumefantrin war bei kulturadaptierten Parasiten im Allgemeinen höher als bei den anfänglichen Ex-vivo-Werten. Bei acht Isolaten mit ursprünglichen Ex-vivo-Lumefantrin-IC50-Werten >30 nM (mittlerer IC50 39,5 nM) lagen die nachfolgenden IC50-Werte, die nach einer Kultivierung für 4 oder mehr Wochen und dann nach dem Einfrieren, Auftauen, Wachstum in der Kultur und wiederholten Tests gemessen wurden, im Allgemeinen niedriger als die anfänglichen Ex-vivo-Werte (Tabelle 5). Allerdings lagen die IC50-Werte nach Kulturanpassung für diese acht Isolate aus Norduganda, die vor (mittlerer IC50 13,2 nM) oder nach (mittlerer IC50 16,9 nM bestimmt in Uganda und 7,4 nM bestimmt in den USA) der Gefrier-Tau-Rekultivierung gemessen wurden, über den Werten für gesammelte Parasiten aus Ostuganda zum direkten Vergleich mit den Isolaten aus Norduganda (mittlerer IC50 6,9 nM für 38 Isolate) oder für eine größere Gruppe früher veröffentlichter Isolate (mittlerer IC50 5,1 nM für 365 Isolate32).

Das Auftreten von P. falciparum mit den Mutationen PfK13 C469Y oder A675V in Norduganda gibt Anlass zur Sorge hinsichtlich der Auswahl von Parasiten, die sowohl gegen Artemisinine als auch gegen ACT-Partnermedikamente resistent sind, was möglicherweise dazu führt, dass Erstlinien-ACTs Malaria nicht wirksam behandeln können. Um die aktuelle Situation besser einschätzen zu können, haben wir direkt die Arzneimittelempfindlichkeiten von Isolaten verglichen, die im Jahr 2021 von Malariapatienten in Norduganda, wo die PfK13-Mutationen in den letzten Jahren häufig auftraten, und Ostuganda, wo sie selten auftraten, gesammelt wurden. Wir fanden erwartungsgemäß eine hohe Prävalenz der C469Y- und A675V-Mutationen in Isolaten aus Norduganda, obwohl die Prävalenz auch in Isolaten aus Ostuganda höher war als zuvor beobachtet21. Unter Verwendung des DHA-RSA, dem Standardmaß für die In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber Artemisininen, sahen wir einen Zusammenhang zwischen der C469Y-Mutation, nicht jedoch der A675V-Mutation (für die nur wenige Proben zur Untersuchung zur Verfügung standen), und einem verringerten Überleben der Parasiten. Bei Verwendung standardmäßiger Wachstumshemmungstests war die Empfindlichkeit gegenüber Lumefantrin und DHA, jedoch nicht gegenüber anderen getesteten Arzneimitteln, bei Isolaten aus Norduganda im Vergleich zu Ostuganda signifikant geringer. Betrachtet man eine viel größere Anzahl von Isolaten, die zwischen 2015 und 2021 gesammelt wurden, für die jedoch nur Wachstumshemmungstests verfügbar waren, war eine verringerte Anfälligkeit für Lumefantrin stark mit der PfK13-469Y-Mutation verbunden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Auftreten einer teilweisen Resistenz gegen Artemisinine mit einer verringerten Aktivität von Lumefantrin einhergeht, was möglicherweise einen Verlust der Wirksamkeit von Artemether-Lumefantrin, dem Mittel der ersten Wahl gegen Malaria in Uganda und den meisten Teilen Afrikas, vorhersagt.

Es ist wichtig festzustellen, ob die kürzlich in Norduganda identifizierten PfK13-Mutationen19,20,21,22 mit einem erhöhten Überleben der Parasiten nach der Exposition gegenüber Artemisininen verbunden sind. Frühere Arbeiten identifizierten einen Zusammenhang zwischen der 675V-Mutation und der klinisch verzögerten Clearance nach der Behandlung mit Artemisininen in Südostasien7. In einer aktuellen Studie aus Norduganda waren beide Mutationen mit einer klinisch verzögerten Clearance verbunden und nur die 675V-Mutation mit ex vivo erhöhtem Überleben nach DHA-Exposition, die Analysen wurden jedoch durch relativ wenige mutierte Isolate für die Studie eingeschränkt22. Eine Studie aus Ruanda zeigte, dass im Jahr 2019 gesammelte einzelne Isolate mit den Mutationen 469 F, 561H und 675 V in vitro eine erhöhte Überlebensrate im Vergleich zu einem Wildtyp-Parasiten aufwiesen18, aber unseres Wissens war die 469Y-Mutation zuvor nicht mit einer erhöhten Überlebensrate in Verbindung gebracht worden ein RSA. In unseren Studien war die 469Y-Mutation durch RSA signifikant mit einem verbesserten Überleben verbunden. Daher untermauern unsere Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass beide kürzlich in Norduganda aufgetretenen PfK13-Mutationen mit einer Artemisinin-Partialresistenz verbunden sind.

Es wurde gezeigt, dass Polymorphismen in einer Reihe von P. falciparum-Proteinen mit einer partiellen Artemisinin-Resistenz assoziiert sind, entweder in Verbindung mit PfK13-Mutationen oder unabhängig davon8,10, aber konsistente Mediatoren außer PfK13 wurden nicht identifiziert, und die Vermittlung der Resistenz scheint hoch zu sein abhängig vom genetischen Hintergrund des Parasiten42. Unsere Auswertung der Zusammenhänge zwischen Polymorphismen in 23 Kandidatengenen und verbessertem Überleben im RSA identifizierte eine Reihe von Polymorphismen mit mäßigem Zusammenhang mit erhöhtem Überleben (Ergänzungstabelle 2) und den stärksten Zusammenhang mit Polymorphismen in zwei Genen, die für Falcipain-2a und Pfcoronin kodieren.

Bemerkenswerterweise wiesen alle Isolate mit einer RSA-Überlebensrate von >5 % trotz Fehlens der PfK13-469Y-Mutation Mutationen in Falcipain-2a auf. Von den 17 in Falcipain-2a identifizierten Mutationen wurden 11 auch in Isolaten aus Südostasien identifiziert, in denen Falcipain-2a-Haplotypen mit einem erhöhten RSA-Überleben assoziiert waren9. Falcipain-2a ist eine Hämoglobinase, die zusammen mit anderen Proteasen eine Schlüsselrolle bei der Hydrolyse von Hämoglobin spielt, um Aminosäuren für den Stoffwechsel des Parasiten bereitzustellen43. Der Verlust der Falcipain-Aktivität aufgrund der Behandlung mit spezifischen Inhibitoren oder Gen-Knockout schwächte die Antimalaria-Aktivität von DHA deutlich ab, was darauf hindeutet, dass eine Falcipain-vermittelte Proteolyse von Hämoglobin für eine effiziente Aktivierung von Artemisininen erforderlich ist44. Diese Ergebnisse stimmen mit unserem Verständnis überein, dass die Umwandlung von Artemisininen durch Häm nach der Freisetzung aus Hämoglobin in toxische freie Radikale eine Voraussetzung für die wirksame Wirkung von Artemisininen ist45. Interessanterweise wurde eine Mutation, die für ein Falcipain-2a-Stoppcodon kodiert, bei Parasiten identifiziert, die in vitro auf Resistenz gegen Artemisinin selektiert wurden, diese Selektion erfolgte jedoch nach dem Auftreten einer PfK13-Mutation6. Insgesamt deuten die verfügbaren Daten darauf hin, dass bestimmte Mutationen in Falcipain-2a unabhängig von oder in Verbindung mit Mutationen in PfK13 eine Artemisinin-Partialresistenz vermitteln können.

In Studien an Parasiten aus dem Senegal wurde die In-vitro-Selektion von P. falciparum mit steigenden DHA-Konzentrationen auf Parasiten mit erhöhtem Überleben im Zusammenhang mit Mutationen in Pfcoronin, nicht jedoch PfK1310, selektiert; Die Auswirkungen von Pfcoronin-Mutationen auf das Überleben nach DHA-Exposition variierten je nach genetischem Hintergrund des Parasiten46. Pfcoronin ist ein Mitglied der WD40-Propellerdomänen-Proteinfamilie, von der bekannt ist, dass sie mit Aktinfilamenten und intrazellulären Membranen assoziiert47,48. Die biologische Grundlage der Beiträge von Pfcoronin-Mutationen zur Artemisinin-Partialresistenz ist unbekannt, es wurde jedoch festgestellt, dass die Auswirkungen von Pfcoronin-Mutationen durch PfK13-Mutationen maskiert werden, was darauf hindeutet, dass Mutationen in den beiden Proteinen die gleichen Parasitenmechanismen beeinflussen könnten46.

Zusätzliche Polymorphismen waren mit einem veränderten RSA-Überleben verbunden. Eine Deletion in pfubp1, das ein mutmaßliches deubiquitinierendes Enzym kodiert, war mit einer erhöhten Überlebensrate des Rings verbunden. Zwei Mutationen im P. chabaudi-Homolog dieses Proteins wurden mit einer Artemisinin-Resistenz in einer Maus-Genkreuzung in Verbindung gebracht49; Mutationen waren mit einer Artemisinin-Teilresistenz bei P. falciparum in vitro50 und P. berghei bei Mäusen51, jedoch nicht mit einer klinischen Teilresistenz52 verbunden; und durch Affinitätsmarkierung wurde gezeigt, dass das Protein mit PfK1353 assoziiert. Unsere Ergebnisse stützen diese begrenzten Daten, die PfUBP1-Mutationen als potenzielle sekundäre Mediatoren der Artemisinin-Partialresistenz identifizieren. Interessanterweise war das Vorhandensein einer der 15 PfK13-Mutationen in der Präpropellerdomäne mit einer verringerten Überlebensrate verbunden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Mutationen, vielleicht paradoxerweise, die Artemisinin-Aktivität steigern, was den gegenteiligen Effekt von Propellerdomänenmutationen darstellt. Ein Polymorphismus in einem Protein unbekannter Funktion (Pf3D7_1433800) war ebenfalls mit einer erhöhten Überlebensrate verbunden. Ein anderer Polymorphismus in diesem Protein wurde in denselben Experimenten ausgewählt, die Pfcoronin als potenzielle Resistenzdeterminante identifizierten10, aber dies schien nicht zum erhöhten Überleben des Rings beizutragen46.

Wir verglichen auch die Anfälligkeit von P. falciparum-Isolaten mit einer Gruppe von sieben Antimalariamitteln unter Verwendung eines Standard-Wachstumshemmungstests. Betrachtet man nur Isolate, die im gleichen Zeitraum im Jahr 2021 gesammelt und untersucht wurden, war die Anfälligkeit gegenüber zwei Arzneimitteln, Lumefantrin und DHA, bei Isolaten aus Norduganda geringer als bei Isolaten aus Ostuganda. Betrachtet man einen viel größeren Satz von Isolaten, die in den Jahren 2015–21 gesammelt wurden, waren Polymorphismen in neun Genen mit einer veränderten Lumefantrin-Empfindlichkeit im Vergleich zu der von Wildtyp-Parasiten verbunden. Diese Ergebnisse verdeutlichen mögliche Mediatoren oder Faktoren, die mit einer veränderten Lumefantrin-Empfindlichkeit verbunden sind. Erstens waren die Mutationen PfK13 469Y und 675 V stark mit einer verringerten Anfälligkeit verbunden, was die Möglichkeit einer teilweisen Resistenz gegen Artemisinine hervorhebt, die mit einer verringerten Anfälligkeit gegenüber Partnerarzneimitteln einhergeht. Diese Ergebnisse deuten jedoch nicht auf eine kausale Rolle von PfK13-Mutationen bei der veränderten Lumefantrin-Empfindlichkeit hin. Zweitens waren drei Mutationen im mutmaßlichen Arzneimitteltransporter PfMDR1 mit einer veränderten Lumefantrin-Empfindlichkeit verbunden; Eine davon, 86Y, kam zuvor in Afrika häufig vor, wurde durch die Exposition gegenüber Lumefantrin15 selektiert und war in früheren Studien31,32 und unserer aktuellen Analyse mit einer erhöhten Arzneimittelanfälligkeit verbunden. Drittens waren Mutationen in einer mutmaßlichen Phospholipase mit einer veränderten Lumefantrin-Empfindlichkeit verbunden. Mutationen in diesem Protein wurden zuvor durch In-vitro-Exposition gegenüber Primaquin ausgewählt und mit einer verringerten Anfälligkeit für dieses Medikament in Verbindung gebracht54. Interessanterweise waren Mutationen mit Funktionsverlust in einer anderen vorhergesagten P. falciparum-Phospholipase, PfPARE, mit einer verringerten Anfälligkeit für MMV011438, eine Reihe von Pepstatinestern55, und den Antimalariakandidaten Oxoborol AN1376256 verbunden, vermutlich aufgrund des Verlusts der intrazellulären Arzneimittelaktivierung. Viertens waren unterschiedliche Polymorphismen in einem vorhergesagten Transkriptionsfaktor von P. falciparum, ApiAP257, sowohl mit einer erhöhten als auch einer verringerten Lumefantrin-Empfindlichkeit verbunden. Verschiedene Mutationen in diesem Protein waren in einem chemogenetischen Screening54 mit einer verminderten Anfälligkeit gegenüber drei verschiedenen, als Antimalariamittel entwickelten Verbindungen und in einer genomweiten Assoziationsstudie58 gegenüber Chinin verbunden. Fünftens waren Mutationen in den mutmaßlichen Arzneimitteltransportern PfMRP1 und PfMRP2 mit Veränderungen der Lumefantrin-Empfindlichkeit verbunden. Weitere Mutationen in PfMRP1 wurden bei afrikanischen Parasiten beschrieben und in verschiedenen Studien mit einer vorherigen Therapie mit Artemether-Lumefantrin59 und einer verminderten Anfälligkeit gegenüber Chloroquin, Artemisinin, Mefloquin, Lumefantrin, Piperaquin und/oder DHA in Verbindung gebracht60,61,62,63. Eine Deletion im PfMRP2-Upstream-Promotor64 und eine Reihe von Polymorphismen in der kodierenden Sequenz65 waren mit einer verringerten Empfindlichkeit gegenüber Aminochinolinen verbunden. Sechstens waren SNPs in Genen, die für Hämoglobinasen, die Cysteinproteasen Falcipain-2a und Falcipain-343 und die Asparaginprotease Plasmepsin-I66, kodieren, mit einer veränderten Lumefantrinaktivität verbunden. Wie oben erwähnt, führte eine verringerte Aktivität von Falcipain-2a durch Enzymhemmung oder Gen-Knockout zu einer verringerten Anfälligkeit für Artemisinine44, und eine veränderte Funktion anderer Hämoglobinasen könnte sich auch auf die Artemisinin-Wirkung auswirken.

Die Identifizierung von Parasiten mit ungewöhnlich hohen Lumefantrin-IC50-Werten aus Norduganda weckte das Interesse an der Charakterisierung dieses Phänotyps. Der Phänotyp erwies sich jedoch als instabil. Das Wachstum von Parasiten in Kultur über einen Zeitraum von 4 oder mehr Wochen zur Etablierung kulturadaptierter Parasiten ging mit einer Erhöhung der Anfälligkeit gegenüber Lumefantrin einher. Daher scheint es, dass einige Parasiten mit verminderter Lumefantrin-Empfindlichkeit in Norduganda zirkulieren, dass aber in den gemischten Isolaten, die typischerweise in dieser Region vorkommen, die weniger anfälligen Stämme während der Kultur routinemäßig von arzneimittelempfindlicheren Stämmen verdrängt werden, und/oder Phänotypen mit verminderter Anfälligkeit gehen in vitro aufgrund ungeklärter Umweltunterschiede zwischen dem In-vivo- und In-vitro-Wachstum von Parasiten verloren.

Unsere Studie hatte einige wichtige Einschränkungen. Erstens haben wir aufgrund der logistischen Herausforderungen bei der Untersuchung von Isolaten aus dem Agago-Distrikt in unserem Labor im Tororo-Distrikt (ca. 400 km entfernt) Parasiten für RSAs nur über einen Zeitraum von zwei Monaten gesammelt, wodurch unsere Analyse auf 57 Isolate aus Norduganda beschränkt wurde. Zweitens beschränkten wir uns aufgrund unseres Interesses an der Untersuchung von im gleichen Zeitraum gesammelten Isolaten auf die Analyse von RSAs für 42 Isolate aus Ostuganda. Die begrenzte Stichprobengröße schränkte die Aussagekraft unserer RSA-Analysen ein. Drittens unterschieden sich die Teilnehmer, die Proben aus Nord- und Ostuganda zur Verfügung stellten, in mancher Hinsicht, insbesondere im geringeren Alter und höherer Parasitämie bei den Teilnehmern aus Ostuganda; Es ist jedoch nicht zu erwarten, dass sich diese Unterschiede auf Ex-vivo-Messungen der Arzneimittelanfälligkeit auswirken würden. Viertens waren die Isolate in der Regel polyklonal, wie es für Infektionen in Regionen Afrikas mit hoher Übertragungsrate typisch ist. Ex-vivo-IC50-Werte stellten zwangsläufig Durchschnittswerte der Aktivitäten von Klonen in einer Probe dar, und bei Genomanalysen sind möglicherweise einige Sequenzen von Minderheitsklonen übersehen worden. Fünftens begrenzte unser Multiplex-Deep-Sequencing-Ansatz die Analyse von Teilen einiger Gene aufgrund unvollständiger Kachelung oder unzureichend ausgewogener PCR-Bedingungen. Sechstens waren unsere Studien auf die Zielgene beschränkt und nicht in der Lage, die gesamte Variationsvielfalt im Genom in Bezug auf die Arzneimittelanfälligkeit zu charakterisieren; Weitere Studien, darunter genomweite Assoziationsstudien und genetische Kreuzungen, werden in dieser Hinsicht hilfreich sein. Trotz dieser Einschränkungen sind wir der Meinung, dass die identifizierten starken Zusammenhänge gültig sind, aber zusätzliche Untersuchungen einer größeren Anzahl von Isolaten, die in einem weiten geografischen Bereich gesammelt wurden, haben sicherlich hohe Priorität.

Die klinischen Auswirkungen einer verringerten Aktivität von Artemisininen und Lumefantrin gegen P. falciparum, das in Norduganda zirkuliert, sind unbekannt. Die Beseitigung von Parasiten mit PfK13-469Y- und 675-V-Mutationen war nach der Behandlung mit intravenösem Artesunat im Vergleich zu Wildtyp-Parasiten verzögert22. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Reaktionen auf die Behandlung schwerer Malaria, die durch mutierte Parasiten verursacht wird, möglicherweise langsam sind, was zu einer erhöhten schweren Morbidität und Mortalität führt. In Ruanda war die Clearance von Parasiten mit einer anderen PfK13-Mutation, 561H, im Vergleich zu der von Wildtyp-Parasiten nach der Behandlung mit Artemether-Lumefantrin verzögert, aber die durch Standardmessungen beurteilte Wirksamkeit der Behandlung unterschied sich nicht zwischen Patienten, die mit mutierten Parasiten und Wildtyp-Parasiten infiziert waren17 . Die Auswirkungen der ugandischen 469Y- und 675-V-Mutationen auf die Behandlungswirksamkeit von ACTs sind nicht bekannt. Allerdings scheinen veränderte Reaktionen sowohl auf Artemisinine als auch auf Lumefantrin, wie aus unseren Daten hervorgeht, wahrscheinlich die Reaktionen auf die Therapie mit Artemether-Lumefantrin, dem Mittel der ersten Wahl gegen Malaria in Uganda und den meisten Malaria-endemischen Ländern in Afrika, zu beeinflussen. Studien in Regionen mit PfK13-mutierten Parasiten zur Malariawirksamkeit von intravenösem Artesunat zur Behandlung schwerer Malaria und von Artemether-Lumefantrin zur Behandlung unkomplizierter Malaria haben daher höchste Priorität.

Für Bewertungen, die RSAs und Wachstumshemmungstests umfassten, wurden vom 31. Mai bis 17. August 2021 Proben an drei Standorten entnommen: Patongo Health Center III, Agogo District, im Norden Ugandas; Tororo District Hospital, Tororo District, im Osten Ugandas; und Busiu Health Center IV, Distrikt Mbale, ebenfalls im Osten Ugandas (Abb. 1). Für Bewertungen, die nur Wachstumshemmungstests umfassten, wurden Proben von Dezember 2015 bis August 2021 von den oben genannten Standorten im Osten Ugandas sowie vom Masafu Hospital im Bezirk Busia, ebenfalls im Osten Ugandas, entnommen, wie zuvor beschrieben32. Für das Patongo Health Center wurden zweimal wöchentlich Proben entnommen und am Tag der Entnahme zu unserem Labor in Tororo transportiert. Proben von Standorten im Osten Ugandas wurden täglich gesammelt, soweit verfügbar. Es wurden Isolate von Patienten im Alter von 6 Monaten oder älter gesammelt, die sich an den Standorten mit klinischen Symptomen von Malaria, einem positiven Giemsa-gefärbten Blutausstrich für P. falciparum und keinen Anzeichen einer schweren Erkrankung vorstellten. Patienten, die angaben, in den letzten 30 Tagen eine Malariabehandlung angewendet zu haben oder Hinweise auf eine Infektion mit anderen Plasmodium-Arten hatten, wurden ausgeschlossen. Von allen Teilnehmern wurde eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt. Eltern oder Erziehungsberechtigte von Kindern unter 18 Jahren haben in ihrem Namen eine schriftliche Einwilligung erteilt; Kinder im Alter von 8–17 Jahren stimmten zu. Vor Beginn der Therapie wurden 2–5 ml venöses Blut in einem Heparinröhrchen gesammelt. Den Teilnehmern wurde nach der Probenentnahme Artemether-Lumefantrin gemäß den nationalen Richtlinien verabreicht. Die Studien wurden vom Forschungs- und Ethikausschuss der Makerere-Universität, dem Uganda National Council for Science and Technology und dem Ausschuss für Humanforschung der University of California, San Francisco genehmigt.

Parasitämie wurde mit Giemsa-gefärbten dünnen Filmen unter Verwendung eines Lichtmikroskops mit einer 100-fachen Objektivlinse und Zählung von 1000 oder mehr Erythrozyten identifiziert. Aus logistischen Gründen (Proben wurden zu verschiedenen Tageszeiten und an verschiedenen Orten entnommen) wurden die Proben bei 4 °C gelagert, wobei die Kultur im Allgemeinen am Morgen nach der Probenentnahme begonnen wurde. Parasiten wurden wie zuvor beschrieben in Kultur gebracht32. Das Blut wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur zentrifugiert, Plasma und Buffy Coat wurden entfernt und das Erythrozytenpellet wurde dreimal mit RPMI 1640-Medium (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 37 ° C gewaschen. Das Pellet wurde in Komplettmedium bestehend aus RPMI 1640 mit 25 mM HEPES, 24 mM NaHCO3, 0,1 mM Hypoxanthin, 10 μg/ml Gentamicin und 0,5 % AlbuMAX II (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) resuspendiert, um einen Hämatokrit zu erzeugen von 50 %. Darüber hinaus wurden 4 Aliquots der gewaschenen Pellets von etwa 10 μl zur anschließenden molekularen Analyse auf Whatman 3MM-Filterpapier (Cytivia, Marlborough, MA, USA) getupft.

Die Arzneimittelempfindlichkeit wurde in Proben mit mindestens 0,3 % Parasitämie mithilfe eines 72-Stunden-Mikroplatten-Wachstumshemmungstests mit SYBR-Green-Detektion bewertet, wie zuvor beschrieben32. Die von Medicines for Malaria Venture bereitgestellten Studienverbindungen (Chloroquin, Monodesethylamodiaquin, Piperaquin, Lumefantrin, Mefloquin, Dihydroartemisinin und Pyronaridin) wurden in Dimethylsulfoxid (außer destilliertem Wasser für Chloroquin) als 10-mM-Vorräte gelöst und bei –20 °C gelagert. Die Arzneimittel wurden in Vollmedium in 96-Well-Mikrotiterplatten (50 μl pro Well), einschließlich wirkstoff- und parasitenfreier Kontrollvertiefungen, seriell um den Faktor 3 verdünnt, wobei die Konzentrationen optimiert wurden, um vollständige Dosis-Wirkungs-Kurven zu erfassen. Die Kulturen wurden mit nicht infizierten Erythrozyten aus örtlichen Blutbanken auf ein Gesamtvolumen von 200 μl pro Vertiefung bei 0,2 % Parasitämie und 2 % Hämatokrit verdünnt. Die Platten wurden 72 Stunden lang bei 37 °C in einem befeuchteten modularen Inkubator (Billups Rothenberg, San Diego, CA, USA) bei 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 gehalten. Nach 72 Stunden wurde der Inhalt der Vertiefungen resuspendiert und 100 μl Kultur pro Vertiefung auf schwarze Platten mit 96 Vertiefungen übertragen, die 100 μl SYBR Green-Lysepuffer pro Vertiefung (20 mM Tris, 5 mM EDTA, 0,008 % Saponin, 0,08 % Triton X-100) enthielten und 0,2 μL/ml SYBR Green I (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)) und gemischt. Die Platten wurden 1 Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert und die Fluoreszenz wurde dann mit einem FLUOstar Omega-Plattenlesegerät (BMG LabTech, Cary, NC, USA; 485 nm Anregung und 530 nm Emission) gemessen. Um die Stabilität der Arzneimittelbestände zu überwachen, wurden die Laborkontrollstämme P. falciparum Dd2 (MRA-156) und 3D7 (MRA-102) (BEI Resources, Manassas, VA, USA) in Kultur gehalten und ungefähr getestet (beginnend im Ringstadium). monatlich, nach Synchronisierung mit einer Magnetsäule (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, USA). Zur Anpassung der Parasiten an die Langzeitkultur wurden frisch gesammelte Isolate bei Bedarf unter Verwendung von Spendererythrozyten auf 1 % Parasitämie verdünnt und unter den oben beschriebenen Bedingungen bei 2 % Hämatokrit in RPMI-Komplettmedium kultiviert. Die Kulturen wurden nach Bedarf mit nicht infizierten Erythrozyten verdünnt. Nach ca. 4 Wochen wurden Parasiten im Ringstadium in Glycerolyte-57-Lösung (Frensenius Kabi AG, Hamburg, Deutschland) kryokonserviert und in flüssigem Stickstoff in der Gasphase gelagert.

Standardmäßige Wachstumshemmungstests sagen keine klinisch verzögerte Clearance im Zusammenhang mit Artemisinin-resistenten Parasiten voraus. Daher wurde die DHA-Empfindlichkeit mithilfe des Ex-vivo-RSA gemessen, wie zuvor beschrieben67. Kurz gesagt, frisch kultivierte Parasiten mit mindestens 0,2 % Parasitämie, die wie oben für Wachstumshemmungstests hergestellt wurden, wurden 6 Stunden lang mit 700 nM DHA oder, für Kontrollen, 0,1 % DMSO inkubiert. Isolate mit >1 % Parasitämie wurden auf 1 % verdünnt; Isolate mit ≤ 1 % Parasitämie wurden zu Beginn der Parasitämie kultiviert. Nach 6 Stunden wurden die Zellen gewaschen, um den Wirkstoff zu entfernen, und die Kultur wurde weitere 66 Stunden lang fortgesetzt. 72 Stunden nach Kulturbeginn wurden mit Giemsa gefärbte dünne Ausstriche hergestellt. Kulturen galten als lebensfähig und für die Beurteilung geeignet, wenn die Kontrollparasitämie ≥ 0,2 % und auch ≥ 25 % der Ausgangsparasitämie betrug. Parasitämien wurden in Kontroll- und behandelten Kulturen gezählt und das RSA-Überleben wurde als Anteil lebensfähiger Parasiten in den mit DHA behandelten Kulturen im Vergleich zu den Kontrollen ausgedrückt.

Gensequenzen und Kopienzahl wurden durch MIP-Erfassung und Tiefensequenzierung analysiert, wie zuvor beschrieben21,32,68. Für die MIP-Erfassung haben wir insgesamt 80 Gene ausgewählt, die aufgrund bekannter oder potenzieller Rollen bei der veränderten Anfälligkeit für Standard-Malariamittel oder in der Entwicklung befindliche Verbindungen ausgewählt wurden (Ergänzungstabelle 1) und dabei zuvor veröffentlichte und neu entwickelte Sonden (Ergänzungstabelle 9) verwendet. Neuartige Sonden wurden mit der MIPTools-Software (Version 0.19.12.13) entworfen. Die DNA wurde wie zuvor berichtet mit Chelex-100-Extraktionspuffer isoliert, wobei 0,01 % Tween 20 anstelle von Saponin21 verwendet wurde. MIP-Erfassung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung erfolgten wie zuvor beschrieben68. Sequenzierungslesungen sind im Sequence Read Archive des National Center for Biotechnology Information (NCBI) verfügbar (Zugangsnummer PRJNA850445). MIPTools wurde verwendet, um rohe Sequenzierungsdaten zu organisieren und Variantenaufrufe durchzuführen. Einzelne Genotypen wurden für polymorphe Stellen zugewiesen, die durch mindestens 10 eindeutige molekulare Identifikatoren (UMIs) abgedeckt waren, und Varianten mussten eine Allelzahl innerhalb der Probe von ≥3 UMIs für alternative Allele und ≥2 UMIs für Referenzallele aufweisen. Die Kopienzahlen wurden auf der Grundlage der durch Proben und Sonden normalisierten Tiefe der Sequenzabdeckung von 31 einzigartigen Sonden für pfmdr1 und 21 Sonden für Plasmepsin 2/3 geschätzt. Als Kontrollen dienten der Dd2-Stamm, der amplifiziertes pfmdr1 enthält und eine Einzelkopie für Plasmepsin 2/3 ist, und der G8-Subklon von KH001_053 (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Selina Bopp und der TRAC-Kollaboration), der mehrere Kopien von Plasmepsin 269 enthält. Die Komplexität der Infektion (COI) wurde anhand von Genotypisierungsdaten geschätzt, die durch MIP-Sequenzierung unter Verwendung von THE REAL McCOIL generiert wurden, einem Markov-Ketten-Monte-Carlo-Modell, das die Allelhäufigkeit und den COI von Proben schätzt70.

IC50-Werte wurden durch Auftragen der Fluoreszenzintensität gegen den Logarithmus der Arzneimittelkonzentration abgeleitet und mithilfe einer Hill-Gleichung mit vier Parametern in Prism (Version 9.0) an eine nichtlineare Kurve angepasst, wie zuvor beschrieben32. Alle zusätzlichen Analysen wurden in R (Version 4.1.2) durchgeführt. Kategoriale Daten wurden mithilfe zweiseitiger Fisher's Exact-Tests und kontinuierlicher Daten, einschließlich Wachstumshemmungstests und RSAs, mit zweiseitigen Mann-Whitney-Wilcoxon-Tests ausgewertet. Zur Auswertung der IC50-Daten wurden Genotypen als binäre Variablen betrachtet, die durch das Vorhandensein oder Fehlen des Nebenallels bestimmt wurden (gemischte und reine Nebenallel-Genotypen wurden kombiniert). P ≤ 0,01 wurden als signifikant angesehen. Für das RSA-Überleben wurden Loci mit hoher (> 15 %) Prävalenz von Nebenallelen unabhängig voneinander bewertet, wie oben beschrieben, und Loci mit niedriger (≤ 15 %) Prävalenz von Nebenallelen wurden als Aggregatvariablen analysiert, in denen das Vorhandensein eines Nebenalles festgestellt wurde wurde mit dem Hauptallel verglichen. Sowohl für Loci mit hoher als auch mit niedriger Prävalenz wurden p ≤ 0,05 als signifikant angesehen. Für statistisch signifikante Loci wurde das RSA-Überleben auch im Zusammenhang mit den K13-C469Y- und A675V-Mutationen bewertet. Kandidatenorte und K13-Genotypen wurden wie oben beschrieben als binäre Variablen behandelt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle relevanten Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Sequenzdaten sind im Sequence Read Archive des National Center for Biotechnology Information (NCBI) verfügbar (Zugangsnummer PRJNA850445). Daten und Code sind unter https://github.com/PJRosenthalLab/2022_Tumwebaze_NatCom verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Die Studie wurde von den National Institutes of Health (AI075045 (PJR), AI089674 (PJR), TW007375 (PJR) und AI139520 (JAB)) und dem Medicines for Malaria Venture (RD/15/0001 (PJR)) finanziert. Wir danken den Studienteilnehmern und den Mitarbeitern der Kliniken, in denen Proben entnommen wurden. Wir danken Selina Bopp, Sarah Volkman und den Mitgliedern der TRAC-Kollaboration für die freundliche Bereitstellung eines KH001_053-Klons als Kopiennummernkontrolle.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Patrick K. Tumwebaze, Melissa D. Conrad.

Forschungskooperation im Bereich Infektionskrankheiten, Kampala, Uganda

Patrick K. Tumwebaze, Stephen Okitwi, Stephen Orena, Oswald Byaruhanga, Thomas Katairo und Samuel L. Nsobya

University of California, San Francisco, CA, USA

Melissa D. Conrad, Jennifer Legac, Shreeya Garg und Philip J. Rosenthal

Brown University, Providence, Rhode Island, USA

David Giesbrecht, Sawyer R. Smith und Jeffrey A. Bailey

Dominikanische Universität von Kalifornien, San Rafael, Kalifornien, USA

Frida G. Ceja und Roland A. Cooper

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Alle Autoren haben die Experimente konzipiert und gestaltet; PKT, MDC, MO, SO, OB, TK, JL, SG, DG, SRS, FGC und RAC haben die Daten erfasst; PKT, MDC, MO, SO, TK, SG, DG, JAB, RAC und PJR analysierten und interpretierten die Daten; PKT, MDC, SLN, JAB, RAC und PJR spielten beim Verfassen des Manuskripts eine wichtige Rolle. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit Melissa D. Conrad oder Philip J. Rosenthal.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Colin Sutherland, Didier Menard, Dulcie Lautu-Gumal und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vielen Dank, PK, Conrad, MD, Okitwi, M et al. Verminderte Anfälligkeit von Plasmodium falciparum gegenüber Dihydroartemisinin und Lumefantrin in Norduganda. Nat Commun 13, 6353 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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Eingegangen: 23. Juni 2022

Angenommen: 06. Oktober 2022

Veröffentlicht: 26. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33873-x

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