Verbesserte Cytosin-Base-Editoren, die aus TadA-Varianten generiert wurden

Nature Biotechnology Band 41, Seiten 686–697 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Cytosin-Base-Editoren (CBEs) ermöglichen programmierbare genomische C·G-zu-T·A-Übergangsmutationen und umfassen typischerweise ein modifiziertes CRISPR-Cas-Enzym, eine natürlich vorkommende Cytidin-Desaminase und einen Inhibitor der Uracil-Reparatur. Frühere Studien haben gezeigt, dass CBEs, die natürlich vorkommende Cytidin-Desaminasen verwenden, eine ungesteuerte, genomweite Desaminierung von Cytosin verursachen können. Während später über verbesserte CBEs berichtet wurde, die stochastische genomweite Off-Targets verringern, können diese Editoren unter einer suboptimalen On-Target-Leistung leiden. Hier berichten wir über die Erzeugung und Charakterisierung von CBEs, die gentechnisch veränderte Varianten von TadA (CBE-T) verwenden, die ein hohes zielgerichtetes C·G zu T·A über einen sequenzdiversen Satz genomischer Loci ermöglichen und eine robuste Aktivität in Primärzellen zeigen und verursachen keine nachweisbare Erhöhung der genomweiten Mutation. Darüber hinaus berichten wir über Cytosin- und Adenin-Base-Editoren (CABEs), die sowohl die A-zu-I- als auch die C-zu-U-Editierung (CABE-Ts) katalysieren. Zusammen mit ABEs ermöglichen CBE-Ts und CABE-Ts die programmierbare Installation aller Übergangsmutationen mithilfe im Labor entwickelter TadA-Varianten mit verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu zuvor berichteten CBEs.

Cytosin-Base-Editoren (CBEs) sind geneditierende Enzyme, die in der Lage sind, C·G-zu-T·A-Basenpaaränderungen programmierbar in der genomischen DNA lebender Zellen einzuführen. Diese chemische Umwandlung wird durch enzymvermittelte hydrolytische Desaminierung von Cytosin zu Uracil erreicht, das von DNA-Polymerasen als Thymin interpretiert wird1. Bisher bestehen CBEs typischerweise aus vier unterschiedlichen Komponenten: einer natürlich vorkommenden Cytidin-Desaminase (wie APOBEC, AID oder CDA)2, einer beeinträchtigten Form von Cas9, die in der Lage ist, den nicht baseneditierten DNA-Strang um eine oder mehrere Einheiten zu spalten aus Uracil-Glycosylase-Inhibitor (UGI)-Peptid und einer Kernlokalisierungssequenz (NLS)1,2,3. Diese Komponenten sind typischerweise kovalent verschmolzen, können aber auch nichtkovalent zusammengesetzt sein4. CBEs wurden in großem Umfang für die Genreversion und Zelltechnik genutzt und haben das Potenzial, Patienten mit schwächenden genetischen Erkrankungen oder bösartigen Erkrankungen therapeutische Vorteile zu bieten5.

Obwohl mit aktuellen CBE-Base-Editing-Tools2 eine hohe On-Target-DNA-Editierungseffizienz erreicht werden kann, können sie auch eine genomweite, stochastische, von Guide RNA (gRNA) unabhängige Off-Target-Editierung bewirken6,7. Von CBE-Editoren der nächsten Generation wie YE1 (Ref. 8), BE4-PpAPOBEC9 und anderen10 wurde berichtet, dass sie gRNA-unabhängige Off-Target-Ergebnisse abschwächen. Diese Editoren verwenden jedoch natürliche oder leicht manipulierte Varianten der APOBEC-Deaminase und können unter einer verminderten On-Target-Ergebnis leiden -Gezielte Bearbeitungsleistung2,9. Darüber hinaus können APOBEC-basierte CBEs in einigen sequenzspezifischen Kontexten zu einer proximalen Bearbeitung neben der Zielgenomsequenz führen, da APOBEC ineffiziente, aber messbare Fähigkeit besitzt, doppelsträngige DNA (dsDNA) als Substrat zu akzeptieren11.

Adenin-Base-Editoren (ABEs) sind geneditierende Enzyme, die über eine im Labor entwickelte TadA-Deaminase, die Adenin chemisch in Inosin umwandelt, programmierbar A·T- zu G·C-Punktmutationen an Zielorten installieren12. Inosin-Basenpaare mit Cytosin im aktiven Zentrum von DNA-Polymerasen führen nach der DNA-Replikation zu einer Mutation von Inosin zu Guanin. Insbesondere verursachen ABEs nur wenige bis gar keine gRNA-unabhängigen Off-Targets und bearbeiten genomische DNA (gDNA) innerhalb eines präziseren Fensters (Positionen ~3–8, PAM 21–23), was zu weniger Guide-abhängigen Off-Targets führen kann sowie weniger unbeteiligte Bearbeitungen im Vergleich zu CBEs6,13. Darüber hinaus wurde nicht berichtet, dass ABEs auf dsDNA wirken.

Um einem CBE die vorteilhaften Eigenschaften von ABEs zu verleihen, haben wir uns vorgestellt, TadA in ein Enzym umzuwandeln, das zur robusten Cytidin-Desaminierung fähig ist, und haben anschließend eine verbesserte Klasse von CBEs entwickelt, die TadA anstelle einer natürlich vorkommenden Cytidin-Desaminase verwendet. Erfreulicherweise haben frühere Untersuchungen gezeigt, dass ABEs durch die Einbeziehung von UGI14 in Richtung einer geringen, aber nachweisbaren C-zu-T-Bearbeitung formbar sind. Tatsächlich wurde durch strukturgesteuertes Design über eine ABE-Variante, ABE-P48R-UGI, berichtet, die im Vergleich zu ABE7.10 eine erhöhte Cytosinaktivität ermöglichte, jedoch eine hohe TC-Sequenzspezifität aufwies15. Obwohl diese Fortschritte einen Fortschritt in Richtung unserer Ziele darstellten, erkannten wir, dass eine weitere Entwicklung und Weiterentwicklung von TadA erforderlich sein würde, um therapeutisch relevante C·G-zu-T·A-Editierungseffizienzen mit hoher Produktreinheit und ohne Einschränkungen der Substratsequenz zu erreichen.

Beginnend mit ABE8.20-m13 als Vorlage für die Bibliotheksgenerierung führten wir zwei Runden der gerichteten Evolution durch, um Basiseditorvarianten mit verbesserter C·G-zu-T·A-Editierungseffizienz und Beibehaltung der Adenin-Editierung zu generieren. Wir bezeichnen diese Cytosin- und Adenin-Base-Editoren (CABEs), die TadA verwenden, als „CABE-Ts“ und haben diese Editoren hinsichtlich ihrer C·G-zu-T·A- und A·T-zu-G·C-Editierungseffizienzen weiterentwickelt und charakterisiert in Säugetierzellen. Mit CABE-Ts in der Hand haben wir Kristallstrukturen der mit diesen Editoren assoziierten TadA-Desaminase-Varianten bestimmt und eine strukturgesteuerte Mutagenese durchgeführt, um CBE-Ts zu erzeugen, eine besondere Klasse von CBEs, die manipulierte TadA-Desaminasen für hohe C·G zu T· verwenden. Eine Umwandlung in gDNA ohne nennenswerte A·T-zu-G·C-Editierung. Im Vergleich zu BE4 zeigten unsere CBE-Ts vergleichbare On-Target-Editing-Effizienzen, verfügten über ein präziseres Editierfenster, reduzierten die führerabhängige Off-Target-Editierung und zeigten keine nachweisbare gRNA-unabhängige genomweite Off-Target-Editierung. Darüber hinaus zeigten CBE-Ts eine Kompatibilität mit orthogonalen Cas-Enzymen, was ihre potenzielle Anwendung an einem breiteren Spektrum von Zielstellen ermöglicht. Schließlich waren unsere CBE-Ts in primären Zelltypen wie T-Zellen und Hepatozyten hochaktiv, was ihr Potenzial als attraktives Instrument zur Genbearbeitung für therapeutische Anwendungen bestätigte.

Um die Nukleobasensubstrattoleranz von ABE zu verändern, kamen wir zu dem Schluss, dass wir ABE selektiv unter Druck setzen könnten, um seine geringe, aber nachweisbare13,14 Fähigkeit zur C·G-zu-T·A-Basenbearbeitung durch gezielte Evolution und den Einschluss von UGI (zur Hemmung von Uracil) zu erhöhen Reparatur durch UNG2). Zuerst haben wir eine ABE-Bibliothek generiert, die chemisch in der TadA-Region des Editors (ABE8.20-m13 als Vorlage verwendet) oder mittels fehleranfälliger PCR (ABE8.19-m13 als Vorlage verwendet) randomisiert wurde. Die resultierende Bibliothek mit etwa 10 Millionen Mitgliedern enthielt durchschnittlich drei Aminosäuresubstitutionen pro Mitglied. Escherichia coli wurde mit der ABE-Bibliothek, gRNA und einem Selektionsplasmid co-transformiert und später mit tödlichen Antibiotikadosen konfrontiert, die für Mitglieder der ABE-Bibliothek selektiert wurden, die innerhalb eines entsprechenden Antibiotikaresistenzgens C·G-zu-T·A-Änderungen durchführten und so das Gen wiederherstellten Funktion (Abb. 1a – d und Ergänzungssequenz 1). Die Sanger-Sequenzanalyse überlebender Bibliotheksmitglieder (Abb. 1e und ergänzende Abb. 1) ergab, dass die Mehrzahl der mit Antibiotika ausgewählten Klone Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 27 und 49 von TadA enthielten. Da 19 von 20 Varianten mindestens eine Substitution an beiden Positionen enthalten, haben wir die Hypothese aufgestellt, dass Substitutionen an diesen Positionen (E27H und I49K), die sich in der Nähe der Substratbindungstasche befinden, Konformationsänderungen induzieren würden, die TadA in die Lage versetzen würden, die Cytosin-Nukleobase zu binden und zu desaminieren, was bemerkenswert ist kleiner als Adenin.

a, Schematischer Überblick über den Workflow der gerichteten Evolution zur Identifizierung von TadA-Varianten, die zur C-zu-U-Desaminierung fähig sind. b, Schematische Darstellung von Expressions- und Selektionsplasmiden, die in gerichteten Evolutionskampagnen verwendet werden. Links: Base-Editor-Expressionsplasmid, das für ein Bibliotheksmitglied und sgRNA kodiert, rechts: Selektionsplasmid, das für ein nicht funktionierendes Antibiotikaresistenzgen kodiert. Durch die Reversion an Zielstellen wird die Genfunktion wiederhergestellt. c, Überblick über die Entwicklung des CBE-T-Editors durch gerichtete Evolution und Protein-Engineering. d, Schematische Darstellung ausgewählter Basis-Editor-Architekturen. ABE12 enthält eine im Labor entwickelte TadA*-Desaminase, nCas9 (D10A) und einen Kernlokalisierungs-Tag (bpNLS). Der Dual-Editor (z. B. SPACE16) besteht aus einer entwickelten TadA*-Desaminase, nCas9 (D10A), Cytidin-Desaminase rAPOBEC1 sowie zwei UGI-Einheiten und einem bpNLS-Tag. CBEs (z. B. BE4 (Ref. 3)) bestehen aus einer natürlich vorkommenden Cytidin-Desaminase (z. B. rAPOBEC1), nCas9 D10A, zwei Einheiten UGI und einem bpNLS-Tag. CABE-Ts, über die hier berichtet wird, bestehen aus einer TadA-Variante, die zur A-zu-G- und C-zu-T-Bearbeitung (TADAC) fähig ist, nCas9 (D10A), zwei UGI-Einheiten und einem bpNLS-Tag. CBE-Ts, über die hier berichtet wird, bestehen aus einer TadA-Variante, die zur C-to-T-Editierung (TADC) fähig ist, nCas9 (D10A), zwei Einheiten UGI und einem bpNLS-Tag. e, In TadA integrierte Substitutionen in ausgewählten CABE-T-Editoren aus der gerichteten Evolution Runde 1 (CABE-T1) und Runde 2 (CABE-T2). In TadA*8.20 eingebaute Substitutionen im Zusammenhang mit Wildtyp (WT) TadA sind grau hervorgehoben, und diejenigen, die in Runde 1 und 2 der gerichteten Evolution identifiziert wurden, sind violett bzw. orange hervorgehoben. Die Werte in der letzten Spalte stellen die Anzahl der zu jeder Variante hinzugefügten Substitutionen im Vergleich zu WT TadA dar. f, Maximale Umwandlung von C·G zu T·A und A·T zu G·C in HEK293T-Zellen, transfiziert mit menschlichen Expressionsplasmiden, die CABE-T1- und CABE-T2-Editoren oder -Kontrollen kodieren. Werte und Fehlerbalken spiegeln den Mittelwert und die Standardabweichung von n = 3 (Standorte 1–4) oder 4 (Standorte 5 und 6) unabhängigen biologischen Replikaten wider, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.

Quelldaten

Von den überlebenden Bibliotheksmitgliedern wurden 20 Varianten in Säugetierzellen hinsichtlich ihrer Base-Editing-Ergebnisse charakterisiert und viele Varianten, die in der ersten Evolutionsrunde identifiziert wurden, zeigten nennenswerte Grade der C·G-zu-T·A-Editierung (z. B. CABE-T1.2, durchschnittlich). 32,1 %; CABE-T1.17, durchschnittlich 34,9 % an 22 genomischen Standorten), wobei unterschiedliche Grade der A·T- bis G·C-Editierung erhalten blieben (Abb. 1f und ergänzende Abb. 2–4). Architektonisch bestehen diese Basiseditoren aus einer TadA-Variante, die kovalent an das N-terminale Ende einer Cas9-Nickase (nCas9, D10A) fusioniert ist, gefolgt von zwei C-terminalen UGI-Einheiten und einem Kernlokalisierungs-Tag (Abb. 1d). Dementsprechend bezeichnen wir diese dualen A·T-zu-G·C- und C·G-zu-T·A-Editoren als CABE-T1 (Abb. 1c). CABE-T1s lösten an den getesteten genomischen Stellen einen durchschnittlichen > 25-fachen C·G-zu-T·A-Editierungsanstieg gegenüber ABE8,20-m aus (Abb. 1f und ergänzende Abb. 2–4).

Um die Gesamtbearbeitungseffizienz von CABE-T1 weiter zu steigern, haben wir eine CABE-T-Bibliothek mit ca. 10 Millionen Mitgliedern auf der Hintergrundsequenz von CABE-T1.2 erstellt, einem CABE-T1, das robustes C·G gegenüber T·A zeigte Bearbeitung in Säugetierzellen (Abb. 1f). Wir verlangten von den CABE-T1.2-Bibliotheksmitgliedern die Erstellung zweier C·G-zu-T·A-Reversionen sowie zweier A·T-zu-G·C-Änderungen für eine höhere Stringenz bei der Auswahl, um die Antibiotika-Exposition bei höheren Konzentrationen als in zu überstehen vorherige Runde der gerichteten Evolution (Abb. 1b und Ergänzungssequenz 2). Die überlebenden Bibliotheksmitglieder, die als CABE-T2-Varianten bezeichnet werden, wurden sequenzidentifiziert und auf Baseneditierungseffizienz und Nukleobasensubstratverzerrung in Säugetierzellen untersucht (Abb. 1e, f und ergänzende Abb. 5). Insgesamt zeigten Transfektionsexperimente an Säugetieren eine Verbesserung unserer CABE-T2s gegenüber CABE-T1s. Beispielsweise konnten die repräsentativen Varianten CABE-T2.6, CABE-T2.9 und CABE-T2.19 an 22 Genomstandorten durchschnittliche maximale C·G-zu-T·A-Editierungsraten von 53,0 %, 53,6 % und 49,4 % erreichen , wobei auch verschiedene Bearbeitungsebenen von A·T bis G·C beibehalten werden (Abb. 1f und ergänzende Abb. 2, 3 und 6).

Während in der Literatur bereits über CABEs berichtet wurde, erforderten diese Tools die Einbeziehung sowohl der TadA*7.10- als auch der rAPOBEC1-Deaminasen, um die Bearbeitung von Adenin- und Cytosinbasen mit einem einzigen Editor in voller Länge zu ermöglichen16,17,18,19. Die Schaffung von CABE-Ts, die eine TadA-Variante verwenden, die sowohl auf DNA-Adenine als auch auf DNA-Cytosine (TADAC) einwirkt, führte zur Entwicklung eines kompakteren Baseneditors (ca. 700 bp kleiner) mit besseren Ergebnissen bei der Doppelbaseneditierung im Vergleich zu zuvor beschriebenen CABEs. Beispielsweise zeigte CABE-T2.6 im Vergleich zu SPACE16, A&C-BEmax17 und TargetACEmax18 ein ~1,6-fach höheres maximales C·G zu T·A und ein ~2,6-fach höheres maximales A·T zu G·C (Abb. 1f und). Ergänzende Abbildungen 2 und 3).

Um zu beleuchten, wie sich durch gerichtete Evolution identifizierte Aminosäuresubstitutionen auf die Substrattoleranz von TADAC auswirken, haben wir die Kristallstrukturen von TadA*8.20 aus ABE8.20-m13, der Matrize, die zur Entwicklung von CABE-T1 verwendet wurde, und der hier berichteten TADAC-1-Varianten von CABE-T1 bestimmt . Mithilfe struktureller Erkenntnisse wollten wir die Effizienz der C·G-zu-T·A-Bearbeitung und die Substratspezifität durch strukturgesteuertes Bibliotheksdesign optimieren.

Nach der ersten Runde der gerichteten Evolution charakterisierten wir strukturell drei Desaminasen, die CABE-T1 entsprechen (TADAC-1.17, TADAC-1.14 und TADAC-1.19), die nennenswerte Mengen an C·G-zu-T·A-Baseneditierung erzeugten. Obwohl die Gesamtstrukturen dieser Varianten denen von TadA*8.20 ähneln (Abb. 2a), ergaben Strukturanalysen lokale Strukturveränderungen, die die beobachtete erweiterte Substrattoleranz der CABE-T1-Varianten erklären könnten.

a, Überlagerungen zwischen Monomeren der TadA*8.20- und TADAC-1-Varianten (RMSD zwischen 0,4 Å und 0,9 Å für alle Cα-Atome). Die Strukturen von TADAC-1.17 (Protein – blau, ssDNA – orange) und TadA*8.20 (Protein – grün, ssDNA – gelb) sind ähnlich (RMSD von 0,4 Å für alle Cα-Atome), was zeigt, dass die Substitutionen (cyanfarbene Kugeln) keines von beiden sind verändern weder die Proteinstruktur noch den ssDNA-Bindungsmodus, können jedoch aufgrund der Substitution des aktiven Zentrums S82T Auswirkungen auf die Katalyse haben. Die TADAC-1.14-Struktur (gelb) hat aufgrund der Substitution G112H (magentafarbene Kugel) eine andere Konformation für die Schleife zwischen β4 und β5 (magenta) als TadA*8.20. Die TADAC-1.19-Struktur (rosa) weist eine verlängerte Schleife zwischen α1 und β1 (orange) mit einer anderen Konformation auf als TadA*8.20 aufgrund der Substitution E27G (orangefarbene Kugel). C steht für den C-Terminus. b, Oberfläche der Hohlräume des aktiven Zentrums der TadA*8.20- und TADAC-1-Varianten. TADAC-1.17 (zweites Panel) zeigt keinen Unterschied im Vergleich zu TadA*8.20 (erstes Panel). Die TADAC-1.14-Schleife zwischen β4 und β5 (dritte Tafel) verändert die Form des Hohlraums des aktiven Zentrums, wodurch A109 sterisch mit dT(8) von TadA*8.20-ssDNA in Konflikt gerät. Die TADAC-1.19-Schleife zwischen α1 und β1 (viertes Bild) verändert die Form des Hohlraums des aktiven Zentrums, wodurch der Rest R26 sterisch mit dC(10) von TadA*8.20-ssDNA in Konflikt gerät. c: Aktives Zentrum von TADAC-1.17 mit Adenin-Übergangszustandsanalogon 2-Desoxy-8-azanebularin (d8Az; gelb), koordiniert an das Zinkion (graue Kugel). T82 ist 4 Å (cyanfarbene gestrichelte Linie) vom katalytischen Rest E59 entfernt. Schwarze gestrichelte Linien zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an. d, Überlagerung zwischen substratfreien TADAC-1.14-Monomeren (hell- und dunkelgelb) und ssDNA-gebundenem TadA*8.20-Monomer (Protein – grün, ssDNA – gelb), die zwei unterschiedliche Konformationen für die TADAC-1.14-Schleife zwischen β4 und β5 (rosa) zeigt und Magenta) im Vergleich zu TadA*8,20. Diese Schleife enthält die Substitution G112H, und ihre neuen Konformationen würden zu sterischen Konflikten mit dT(8) führen. K49 befindet sich in der Nähe des ssDNA-Rückgrats (~4,5 Å vom dC(10)-Rückgrat entfernt) und kann zur Stabilisierung des Protein-DNA-Komplexes beitragen. e, Überlagerung zwischen substratfreiem TADAC-1.19 (rosa) und ssDNA-gebundenen TadA*8.20-Monomeren, die zeigt, dass die E27G-Substitution E25 in TADAC-1.19 (orange) an eine ähnliche Position wie E27 in TadA*8.20 (grün) bringt und a induziert neue Konformation für die TADAC-1.19-Schleife zwischen α1 und β1 (orange). Gestrichelte Linien zeigen Wasserstoffbrückenbindungen an.

Die Kristallstrukturen von TadA*8.20 und TADAC-1.17 wurden in einem Komplex mit ssDNA-Substrat bestimmt, das das Adenin-Übergangszustandsanalogon 2-Desoxy-8-azanebularin (d8Az) enthielt (Abb. 2, Erweiterte Daten Abb. 1 und 2 und Ergänzende Abb . 7–10). Diese beiden Strukturen sind sehr ähnlich und die vier aus der Evolution abgeleiteten TADAC-1.17-Substitutionen (T17A, A48G, S82T und A142E) verändern die Substrattoleranz nicht drastisch, indem sie die Proteinstruktur oder den ssDNA-Bindungsmodus ändern (Abb. 2a, b). Diese Ergebnisse korrelieren mit den relativ niedrigen C·G-zu-T·A-Reversionen von TADAC-1.17 an Genomstelle 5 im Vergleich zu anderen Varianten in CABE-T1 (ergänzende Abbildung 4). Wir nehmen an, dass die T82-Seitenkette in der Nähe des katalytischen E59-Rests (~4 Å) im aktiven Zentrum eine Rolle bei der Erhöhung der Cytosin-Desaminierung spielen könnte, indem sie den Protonentransfer zu oder von E59 moduliert (Abb. 2c). Darüber hinaus kann die Wasserstoffbindung zwischen E142 und R153 die ssDNA-Bindung durch Stabilisierung der α6-Helix modulieren, wie durch die Wechselwirkungen zwischen F156 und dT(8) in der TADAC-1.17-Struktur veranschaulicht (Extended Data Abb. 2d).

Bemerkenswerterweise zeigt die Kristallstruktur von TADAC-1.14 mit vier Substitutionen (S2H, I49K, Y76I und G112H) einen strukturellen Unterschied in der Schleife zwischen den Strängen β4 und β5 (R107 bis V130) auf der rechten Seite des Hohlraums des aktiven Zentrums (Abb. 2a, d, Erweiterte Daten Abb. 3 und Ergänzende Abb. 11). Diese Schleife enthält eine G112H-Substitution, die ihre Flexibilität und Konformation im Vergleich zu TadA*8.20 dramatisch verändert, indem sie einen sperrigen positiv geladenen Rest einführt (Extended Data Abb. 3d). Diese strukturellen Veränderungen können den Hohlraum des aktiven Zentrums von TADAC-1.14 umgestalten, um sowohl Adenine als auch Cytosine aufzunehmen (Abb. 2b und erweiterte Daten Abb. 3f). Tatsächlich zeigt ein Vergleich mit der Struktur von TadA*8.20, das an ssDNA-Substrat gebunden ist, dass TADAC-1.14 möglicherweise anders an ssDNA bindet als TadA-Varianten mit strenger Adeninspezifität (Abb. 2b und Extended Data Abb. 3d). Wir gehen davon aus, dass der Rest K49 in TADAC-1.14 aufgrund seiner Neupositionierung in der Nähe der Nukleobase dC(10) (~4,5 Å) zur Stabilisierung der Protein-DNA-Wechselwirkungen beitragen kann, die für die Bindung von Cytosin-haltigen ssDNA-Substraten erforderlich sind (Abb. 2d und Extended Data Abb . 3e).

Zusätzlich zu den Störungen auf der rechten Seite des Hohlraums des aktiven Zentrums von TADAC-1.14 zeigt die Auswertung der Struktur von TADAC-1.19, dass andere Substitutionen (E27G und I49N) aus unserer Evolution größere strukturelle Veränderungen auf der linken Seite des Hohlraums des aktiven Zentrums verursachten (Abb. 2a, b, Erweiterte Daten Abb. 4 und Ergänzende Abb. 12). Diese strukturellen Veränderungen werden wahrscheinlich durch die E27G-Substitution verursacht, die zum Verlust essentieller Wasserstoffbrückenbindungen zwischen E27 und A48, I49 und G50 führt. Aufgrund dieser Wasserstoffbindungsverluste kam es zu einer Konformationsänderung, die den Rest E25 von TADAC-1.19 in eine ähnliche Position umorientierte, die zuvor der Rest E27 in TadA*8.20 einnahm (Abb. 2e und Extended Data Abb. 4e). Die Verschiebung von E25 verkürzt die α1-Helix, verändert die Länge und Konformation der Schleife zwischen α1 und β1 (D24 bis P29), die die E27G-Substitution enthält, und entfaltet α5- und α6-Helices (Abb. 2a, e und Extended Data Abb. 4), die den Hohlraum des aktiven Zentrums von TADAC-T1.19 umformt und möglicherweise die Bindung der Zielnukleobasen innerhalb des aktiven Zentrums beeinflusst (Abb. 2b).

Basierend auf den hier beschriebenen Kristallstrukturen (Abb. 2) spekulierten wir, dass strukturelle Veränderungen, die durch Substitutionen in einer der drei verschiedenen Regionen von TadA*8.20 (E27G, S82T und G112H) hervorgerufen wurden, ausreichten, um die Substrattoleranz gegenüber einem Cytosin zu verändern (Abb. 3b). Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Kombination von Aminosäuresubstitutionen aus allen drei Regionen zu einer synergistischen Verbesserung bei der Verbesserung der C·G-zu-T·A-Bearbeitung führen würde. Um diese Hypothese zu testen, wurden acht Stellen innerhalb der Desaminase von CABE-T1 für den Bibliotheksaufbau ausgewählt, einschließlich der oben diskutierten Substitutionen an den Positionen 27, 49, 82, 112 und 142 sowie zwei rational ausgewählte Stellen am oder in der Nähe des aktiven Zentrums von TadA* 8.20 (Abb. 3a,b), um die erste kombinatorische Bibliothek mit 199 Varianten (CABE-T3) zu generieren. Jedes Bibliotheksmitglied wies 2–10 Aminosäuresubstitutionen (durchschnittlich etwa 5,3) in der Desaminase von CABE-T3 auf, und die meisten Bibliotheksmitglieder kodierten mindestens eine Aminosäuresubstitution in allen drei dieser Regionen (Abb. 3b, c und ergänzende Abbildungen). . 13 und 14). Wir haben mehrere CABE-T3-Varianten identifiziert, insbesondere CABE-T3.1 und CABE-T3.155, die eine duale C·G-zu-T·A- und A·T-zu-G·C-Basisbearbeitungsaktivität auf vergleichbarem Niveau aufweisen oder höher als die von CABE-T1 oder CABE-T2 (Abb. 3d und ergänzende Abb. 2, 3 und 15). Insbesondere durch das Screening von Bibliotheksmitgliedern direkt in Säugetierzellen auf relative Base-Editing-Aktivität konnten wir Editoren mit einem breiten Spektrum an Editierungsverhältnissen von C·G zu T·A und A·T zu G·C identifizieren, einschließlich mehrerer Varianten (z (z. B. CABE-T3.55, T3.153 und T3.154), die eine robuste C·G-zu-T·A-Bearbeitung mit minimaler A·T-zu-G·C-Bearbeitung ermöglichen (ergänzende Abbildung 15).

a, Strukturgesteuerter kombinatorischer Bibliotheksdesign-Workflow. Der Übersichtlichkeit halber ist nur ein TadA*8.20-Monomer (grün) mit ssDNA (gelb) dargestellt. Die 23 in der ersten Evolutionsrunde identifizierten Substitutionsstellen werden im ersten Bild als violette Kugeln dargestellt. Basierend auf den Strukturen der TADAC-1-Varianten (Abb. 2) wurden 10 Stellen ausgewählt, 8 aus TADAC-1 (violett) plus 2 rational ausgewählt (cyan), in der Schleife zwischen α1 und β1, α2-Helix, aktives Zentrum , die Schleife zwischen β4 und β5 und der α5-Helix, um die TADAC-3-Varianten zu erzeugen (zweites Panel). Die Substitutionsstellen in TADAC-2 aus der zweiten Evolutionsrunde werden als violette (gleiche Stellen in TADAC-1 identifiziert) und orangefarbene (neue Stellen) Kugeln in der TadA*8.20-Struktur (dritte Tafel) dargestellt. Um die TADC-1-Varianten zu generieren, wurden acht Substitutionen aus der zweiten Evolutionsrunde zu TACAC-3.154 hinzugefügt (viertes Panel). b, Eine weitere Ansicht der TadA*8.20-Struktur (grün), die die Substitutionsstellen zeigt, die zur Erzeugung von TADAC-3 ausgewählt wurden (violette und cyanfarbene Kugeln). Die gestrichelten Kreise heben die drei Regionen hervor, die unserer Hypothese nach für die Veränderung der Substrattoleranz entscheidend sind. c, Substitutionen, die in ausgewählte TadAs aus der strukturgesteuerten Screening-Runde 1 (CABE-T3-Editoren; TADAC-3-Deaminasen) und Runde 2 (CBE-T1-Editoren; TADC-1-Deaminasen) integriert wurden. In TadA*8.20 eingebaute Substitutionen im Vergleich zu WT TadA sind grau hervorgehoben, und diejenigen, die in den gerichteten Evolutionskampagnen 1 und 2 identifiziert wurden, sind violett bzw. orange hervorgehoben. Die Werte in der letzten Spalte stellen die Anzahl der zu jeder Variante hinzugefügten Substitutionen im Vergleich zu WT TadA dar. d, Maximale Umwandlung von C·G zu T·A und A·T zu G·C an Zielgenomorten in HEK293T-Zellen, transfiziert mit menschlichen Expressionsplasmiden, die CABE-T3- und CBE-T1-Base-Editoren oder -Kontrollen kodieren. Werte und Fehlerbalken spiegeln den Mittelwert und die Standardabweichung von n = 3 (Standorte 1–4) oder 4 (Standorte 5 und 6) unabhängigen biologischen Replikaten wider, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.

Quelldaten

Um die Gesamteffizienz der C·G-zu-T·A-Bearbeitung weiter zu steigern und die Substratspezifität gegenüber Cytosin zu optimieren, verwendeten wir gleichzeitig CABE-T3.154, einen Basiseditor, der eine starke Präferenz für die C·G-zu-T·A-Bearbeitung zeigt (Supplementary). Abb. 14 und 15) und kombinatorisch geschichtete acht zusätzliche Substitutionen, ausgewählt aus den Desaminasen von CABE-T2s (Abb. 3 und ergänzende Abb. 5 und 6). Diese Substitutionen befinden sich in der Nähe der DNA-Bindungstasche der Desaminase und ihr Einschluss in CABE-T2s führte zu einer allgemeinen Steigerung der Editierungseffizienz im Vergleich zu CABE-T1s. Wir haben eine 56-köpfige Bibliothek erstellt (ergänzende Abbildung 16), sie mittels Plasmidtransfektion in Säugetierzellen gescreent und festgestellt, dass alle 56 Varianten eine erhebliche C·G-zu-T·A-Editierung erzielten (durchschnittlich 69,2 % über alle Varianten), aber nur verursachten geringes bis nicht nachweisbares Maß an A·T-zu-G·C-Bearbeitung (durchschnittlich 1,8 % über alle Varianten an allen getesteten Standorten; Abb. 3d und ergänzende Abb. 17 und 18). Daher bezeichnen wir diese CBEs, die TadAs enthalten, die auf DNA-Cytosine (TADC) wirken, als CBE-Ts (Abb. 1d).

Nachdem wir die robuste Aktivität unserer CBE-Ts in Hek293Ts beobachtet hatten, waren wir neugierig zu bewerten, wie sich die Cytosin-Base-Editing-Ergebnisse einer repräsentativen Untergruppe unserer 56 CBE-Ts im Vergleich zum zuvor veröffentlichten ABE-P48R-UGI15-Editor an sechs gegebenen Genomstandorten auswirken hoher Grad an Aminosäuresubstitution pro Variante, der für den Zugriff auf unsere Redakteure erforderlich war (Abb. 1e und ergänzende Abb. 16). Tatsächlich fanden wir heraus, dass unsere CBE-Ts ABE-P48R-UGI in Bezug auf die C·G-zu-T·A-Editierungseffizienz, die relative Reinheit des Cytosin-zu-Adenin-Base-Editierungsprodukts und die Substrattoleranz deutlich übertrafen (ergänzende Abbildung 19). Im Vergleich zu ABE-P48R-UGI waren CBE-Ts nicht auf TC-Motive beschränkt, eine Einschränkung des ABE-P48R-UGI-Editors, und daher gehen wir davon aus, dass die hier gemeldeten CBE-Ts universeller anwendbar sind (ergänzende Abbildung 19). .

Um festzustellen, ob die in unseren CBE-Ts vorhandenen TADCs mit orthogonalen Cas-Enzymen kompatibel sind, haben wir die Basenbearbeitungsaktivität einer repräsentativen Untergruppe unserer CBE-Ts untersucht und dabei die Streptococcus pyogenes D10A Cas9-Nickase durch Staphylococcus aureus Cas9-Nickase (SaCas9, PAM) ersetzt : NGGRRT), von dem zuvor gezeigt wurde, dass er mit ABE-Editoren in Säugetierzellen kompatibel ist13,20. Tatsächlich haben wir beobachtet, dass TADCs modulare Enzyme sind und mit SaCas9 kompatibel sind, aber an den sechs getesteten Genomstellen nur mäßige C·G-zu-T·A-Editierungseffizienzen hervorrufen, ähnlich wie BE4-SaCas9-Varianten (ergänzende Abbildung 20).

Um CABE-Ts und CBE-Ts tiefer zu charakterisieren, haben wir gRNAs und in vitro transkribierte (IVT) mRNAs, die eine repräsentative Untergruppe von CABE-T- und CBE-T-Editoren kodieren, chemisch synthetisiert und sie sowohl in sättigenden als auch untersättigenden Dosen in HEK293T-Zellen transfiziert mRNA, die den Editor kodiert (Abb. 4a,b). Für die getesteten CABE-T2s und T3s beobachteten wir eine durchschnittliche 1,53-fache bzw. 1,03-fache Steigerung der maximalen C·G-zu-T·A-Bearbeitung und eine durchschnittliche 2,18-fache bzw. 1,67-fache Verbesserung der A·T-zu-G ·C-Bearbeitung relativ zu SPACE bzw. A&C-BEmax (ergänzende Abbildung 21). Auf allen getesteten Websites beobachteten wir keinen signifikanten Unterschied in den maximalen Bearbeitungsergebnissen für unsere charakterisierten CBE-Ts im Vergleich zu BE4 (P = 0,30, zweiseitiger Wilcoxon-Mann-Whitney-U-Test) und eine bemerkenswerte Differenzierung von den Bearbeitungsergebnissen im Vergleich zum übergeordneten Editor ABE8.20. Über alle getesteten Websites hinweg führten unsere CBE-Ts zu einem durchschnittlichen 262-fachen Anstieg der C·G-zu-T·A-Bearbeitung und einer übereinstimmenden 13-fachen Abnahme der A·T-zu-G·C-Bearbeitung im Vergleich zu ABE8,20 über die gesamte Bearbeitung hinweg Fenster (Abb. 4a – c und ergänzende Abbildungen 2 und 3).

a,b, Maximale Umwandlung von C·G zu T·A und A·T zu G·C in HEK293T-Zellen, transfiziert mit mRNA, die Kern-CBE-T-Varianten kodiert, plus Kontrollen, über acht gezielte Genomorte über synthetische gRNAs bei Sättigung (500 ng). mRNA) (a) und untersättigende Bedingungen (62,5 ng Konstrukt-mRNA + 437,5 ng nichttranslatierte Träger-mRNA) (b). c, Prozentuale Änderung der Bearbeitungsraten von C·G zu T·A (links) und A·T zu G·C (rechts) zwischen CBE-T1-Varianten und ABE8.20 an jeder Zielstandortposition (PAM = Positionen 21–23) an acht getesteten Genomstandorten (Standorte 1 bis 8; Ergänzungstabelle 3). d, mittlere C·G-zu-T·A-Konvertierung an jeder Zielfensterposition, wie auf der x-Achse angegeben, mit Positionsnummerierung, die als PAM definiert ist und als Positionen 21–23 bezeichnet wird. Werte für Farbkarten wurden aus mRNA-Transfektionen unter Sättigungsbedingungen bestimmt. Werte und Fehler spiegeln den Mittelwert und die Standardabweichung von n = 4 (Sättigungsbedingungen) oder 3 (Untersättigungsbedingungen) unabhängigen biologischen Replikaten wider, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.

Quelldaten

Um zu bestätigen, dass unsere CABE-Ts und CBE-Ts über einen C-zu-U-Desaminierungsmechanismus abliefen, verwendeten wir einen In-vitro-Endpunkt-Desaminierungstest, um eine Untergruppe von Editoren als gRNA-programmierte Ribonukleoprotein (RNP)-Komplexe zu bewerten, die auf dsDNA wirken Substrat. In diesem Assay führten CABE-Ts und CBE-Ts nach 24 Stunden an der Zielstelle zu einer durchschnittlichen Desaminierung des C-zu-U-Substrats von ca. 30 % im Vergleich zu ca. 58 % für BE4, ohne dass A-to nachweisbar war -I-Desaminierung für die ausgewerteten CBE-Ts (Extended Data Abb. 5a). Zusätzlich zur C-zu-U-Substrat-Desaminierung führten CABE-Ts auch zu einer bis zu 35 %igen A-zu-I-Desaminierung am Ziel. Insgesamt liefern diese Daten eine orthogonale biochemische Unterstützung für die C-zu-U-Desaminierungsaktivität unserer CABEs und CBEs unter Verwendung von TadA-Varianten. In einem separaten Experiment wurde die scheinbare Geschwindigkeitskonstante der C-zu-U-Desaminierung (kapp, auch als Geschwindigkeit bezeichnet) von CBE-T1.14 RNP auf dsDNA-Substrat mit 0,014 ± 0,006 min−1 gemessen, viel langsamer als die Geschwindigkeit der A-zu-I-Desaminierung für ABE8.20 RNP auf dsDNA (0,17 ± 0,06 min−1; Extended Data Abb. 5b), während ihre Nicking-Rate für den Nichtzielstrang nahezu identisch blieb (Extended Data Abb. 5b und Supplementary Data Abb . 22 und 23).

Trotz einer langsameren Desaminierungsrate in vitro führten CBE-Ts und BE4 bei zellulären Transfektionen, die über 5 Tage durchgeführt wurden, zu einer vergleichbaren vollständigen Desaminierung der Zielstellen (Abb. 4a, b). Wir stellten die Hypothese auf, dass bei genügend Zeit die gesamte C·G-zu-T·A-Bearbeitung oder C-zu-U-Desaminierung durch CBE-Ts Werte erreichen würde, die mit dem kinetisch schnelleren BE4 vergleichbar sind. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führte die Verlängerung der Desaminierungszeit auf 24 Stunden in vitro zu einer vergleichbaren vollständigen C-zu-U-Desaminierung durch CBE-Ts und BE4 (Extended Data Abb. 5a).

Als nächstes untersuchten wir, wie sich die Dosis der zugeführten mRNA auf die Ergebnisse der Bearbeitung der Cytosinbase auswirkt, indem wir Transfektionen von Säugetierzellen bei untersättigten mRNA-Werten durchführten (ergänzende Abbildung 24). Unter diesen Bedingungen behielten CBE-Ts im Vergleich zu Sättigungsbedingungen eine maximale Bearbeitungseffizienz von 55 % bis 70 % bei und zeigten pro Standort eine ähnliche oder bessere Leistung im Vergleich zu APOBEC-basierten CBEs. Die repräsentativen CBE-T-Herausgeber CBE-T1.14, CBE-T1.46 und CBE-T1.52 erreichten durchschnittliche maximale C·G-zu-T·A-Raten von 66 % an acht genomischen Standorten, verglichen mit durchschnittlich 59 % C·G zu T·A, erreicht durch BE4, und durchschnittlich ~35 % C·G zu T·A, erreicht durch YE1 (Abb. 4b und ergänzende Abb. 25). Wir stellen auch fest, dass CBE-Ts ein ähnliches Maß an Indelbildung und C- bis Nicht-T-Bearbeitungen verursachen (ergänzende Abbildung 26 und erweiterte Daten, Abbildung 6a). Vergleichbare Produktreinheit und Indel-Ergebnisse im Vergleich zu CBEs unter Verwendung von Cytidin-Desaminasen sind wahrscheinlich auf die Mechanismen der Reparatur genomischer Uracil-Läsionen zurückzuführen, die unabhängig davon sind, wie die Läsion entstanden ist.

Wie ABEs zeigen wir, dass CABE-Ts und CBE-Ts im Vergleich zu BE4 ein engeres Bearbeitungsfenster haben, wobei die Basisbearbeitungen grob auf die Positionen 3–8 im Protospacer beschränkt sind (Abb. 4c und ergänzende Abb. 27). Darüber hinaus beobachten wir, dass CBE-Ts im Vergleich zu APOBEC-basierten CBEs weniger Bystander-Mutationen erzeugen, da im verengten Zielfenster des Editors durchschnittlich weniger Cs vorhanden sind (Abb. 4d und ergänzende Abb. 27). Für therapeutische Anwendungen stellen wir fest, dass diese Erhöhung der Präzision der Basisbearbeitung ein attraktives Merkmal bei der Betrachtung von Krankheitszielen ist. Während BE4 aufgrund der geringen, aber nachweisbaren Toleranzen von APOBEC für dsDNA als Substrat charakterisiert wurde, auf dsDNA in der Nähe des Protospacers einzuwirken, beobachten wir diese dsDNA-Editierungsaktivität bei unseren CBE-Ts nicht (Extended Data Abb. 6b).

Um die gRNA-abhängige DNA-Off-Target-Editierung von CBE-Ts und CABE-Ts zu charakterisieren, führten wir mRNA-Transfektionen in Zellen mit mehreren gRNAs durch, für die das gRNA-Off-Target-Profil zuvor mit Cas9 und Baseneditoren 1,12,13 charakterisiert wurde ,21. Wir stellen fest, dass CBE-Ts und CABE-Ts im Vergleich zu BE4 und BE4-PpAPOBEC an allen untersuchten Stellen geringere gRNA-abhängige Off-Target-Base-Editing-Frequenzen aufweisen, mit einer 3,06-fachen bzw. 3,53-fachen Abnahme des maximalen C·G zu T· Eine Bearbeitung bzw. ähnliche Ebenen im Vergleich zu den abgeschwächten Off-Target-Editoren YE1 und BE4-PpAPOBEC-H122A (erweiterte Daten, Abb. 7 und ergänzende Abb. 28 und 29).

Um das Verhältnis der durch CABE-Ts und CBE-Ts verursachten Guide-unabhängigen Basisbearbeitung zu BE4 (für C-zu-T-Bearbeitung) oder ABE8.20 (für A-zu-G-Bearbeitung) zu bewerten, führten wir eine klonale Gesamtgenomsequenzierung (WGS) durch expandierte Zellen, die mit mRNA behandelt wurden, die für einen Baseneditor kodiert, und quantifizierte die relative Mutationsrate von C·G zu T·A oder A·T zu G·C wie zuvor beschrieben13 (ergänzende Abbildung 30). Wir fanden heraus, dass sowohl CABE-Ts als auch CBE-Ts im Vergleich zu unbehandelten Proben keinen signifikanten Anstieg der genomweiten C·G- zu T·A-SNVs verursachten, ein Muster, das auch für YE1 und BE4-ppAPOBEC-H122A (alle P >) berichtet wurde 0,05; einseitiger Mann-Whitney-U-Test). Im Gegensatz dazu verursachte BE4 eine mittlere Faltanreicherung um das 3,8-fache für C·G-zu-T·A-Änderungen gegenüber der Kontrolle (P = 7,770e−05; einseitiger Mann-Whitney-U-Test) und BE4-PpAPOBEC verursachte das 1,5-fache des Mittelwerts fache Anreicherung von C·G zu T·A (P = 0,00147; einseitiger Mann-Whitney-U-Test) (Abb. 5a)6,13. CABE-Ts und CBE-Ts verursachten auch keinen signifikanten Anstieg der genomischen A·T- zu G·C-SNVs (alle P > 0,05; einseitiger Mann-Whitney-U-Test) (Abb. 5b) und keine stochastische Desaminierung im gesamten Genom war von unbehandelten Zellen nicht zu unterscheiden.

a, Odds-Ratio-Diagramm für C-zu-T-Mutationen im Vergleich zu allen anderen Mutationstypen in Zellen, die mit CABE-T3.155, CABE-T2.19, CBE-T1.14, CBE-T1.46 und CBE-T1.52 bearbeitet wurden, BE4, YE1, BE4-PpAPO und BE4-PpAPO-H122A im Vergleich zu unbehandelten klonal expandierten Zellen, wobei schwarze Balken das mittlere Odds-Ratio für diese Behandlungsgruppe darstellen (P = 0,8359, 0,7473, 0,9476, 0,8089, 0,9751, 7,770 × 10−). 5, 0,9859, 0,00148 bzw. 0,7473; einseitiger Mann-Whitney-U-Test). Für jede Bedingung werden alle n = 8 biologisch unabhängigen, expandierten Einzelzellpopulationen angezeigt. b, Odds-Ratio-Diagramm für A- zu G-Mutationen im Vergleich zu allen anderen Mutationstypen in Zellen, die mit CABE-T33.155, CABE-T2.19, CBE-T1.14, CBE-T1.46 und CBE-T1.52 bearbeitet wurden ABE8,20 im Vergleich zu unbehandelten klonal expandierten Zellen, wobei schwarze Balken das mittlere Odds-Ratio für diese Behandlungsgruppe darstellen (P = 0,1641, 0,4796, 0,5204, 0,8607, 0,5204 bzw. 0,2527; einseitiger Mann-Whitney-U-Test). Für jede Bedingung werden alle n = 8 biologisch unabhängigen, expandierten Einzelzellpopulationen angezeigt. c, In-vitro-Kinetik der A-zu-I- oder C-zu-U-Desaminierung desselben Substrats, das BE4, ABE8.20 und CBE-T1.14 als ssDNA präsentiert wird, in Abwesenheit von gRNA. Es werden scheinbare Geschwindigkeitskonstanten (kapp) pseudo-erster Ordnung angegeben, die durch Anpassung an eine einzelne exponentielle Anpassung erhalten wurden (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3 unabhängige Wiederholungen). Siehe Daten zur Gelquelle.

Quelldaten

Um die kinetischen Unterschiede bei der ssDNA-Desaminierung zu beleuchten, haben wir in vitro scheinbare Desaminierungsgeschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung (kapp) von Baseneditoren ohne Guide-RNA auf ssDNA-Substrat gemessen. Wir haben die Geschwindigkeit der C-zu-U-Desaminierung durch BE4 mit 0,78 ± 0,02 min−1 gemessen, was etwa 11-fach höher ist als die Geschwindigkeit der A-zu-I-Desaminierung durch ABE8.20 (kapp = 0,071 ± 0,005 min−). 1) für dasselbe ssDNA-Substrat (Abb. 5c und ergänzende Abb. 22). Dieser Unterschied in der Desaminierungsrate von ssDNA stützt weiter frühere Beobachtungen und die hier berichteten Beobachtungen, dass APOBEC-basierte CBEs einzelsträngige Regionen des Genoms stochastisch desaminieren können. Wir fanden heraus, dass CBE-T1.14 die C-zu-U-Desaminierung mit einem kapp von 0,060 ± 0,006 min−1 katalysierte, eine Rate, die nicht von der für die A-zu-I-Desaminierung mit ABE8.20 gemessenen Geschwindigkeit zu unterscheiden ist (Abb. 5c und ergänzende Abb. 22) auf demselben ssDNA-Substrat. Bemerkenswerterweise bleibt der katalytische Rest zwischen ABE8.20 und CBE-Ts unverändert (Abb. 2c, 3a und Extended Data Abb. 1d, 2, 3c).

CBE-Ts haben aufgrund ihrer verbesserten Eigenschaften im Vergleich zu CBEs, die natürlich vorkommende Cytidin-Desaminasen verwenden, ein erhebliches Potenzial für den therapeutischen Einsatz bei der Umkehrung und Stummschaltung von Genen. Um das Bearbeitungspotenzial von CBE-Ts in Primärzellen zu bewerten, haben wir zunächst die Fähigkeit von CBE-Ts untersucht, die Expression von PCSK9, einem für die therapeutische Behandlung von Hypercholesterinämie22 relevanten Ziel, in einem langlebigen primären menschlichen Hepatozyten-Kokultursystem23 zum Schweigen zu bringen. Der Knock-down oder Knock-out des PCSK9-Gens führt zu einem niedrigeren LDL-Cholesterinspiegel (Low Density Lipoprotein) im Blut und senkt somit das Risiko einer Herzerkrankung24,25. Tatsächlich wurden mit ABE8.8 in vivo vielversprechende Ergebnisse beim Spleißstellen-Targeting von PCSK9 erzielt26. In ähnlicher Weise haben wir herausgefunden, dass die mRNA-Transfektion von CBE-T1.46 mit einem synthetischen Leitfaden, der auf das PCSK9-Gen in primären menschlichen Hepatozyten abzielt, eine C·G-zu-T·A-Base-Editing-Effizienz erzielte, die mit BE4 an zwei PCSK9-Zielstellen vergleichbar oder größer als diese ist das Stoppcodon Q555X oder stören das Prä-mRNA-Spleißen an Exon 4 (E4-Spleiß; Abb. 6a). Die Auswertung der PCSK9-Proteinspiegel mittels ELISA zeigt, dass PCSK9 durch CBE-T1.46 an beiden getesteten Zielstellen in Konzentrationen abgebaut wird, die mit BE4 vergleichbar oder höher sind (Abb. 6b). Gleichzeitig wurden bei den mit CBE-T1.46 behandelten Proben an beiden Stellen Erhöhungen des Gesamt-LDL-Rezeptors (LDLR) beobachtet (P < 0,05, < 0,01), was das Potenzial von CBE-T zeigt, einen therapeutisch relevanten phänotypischen Effekt zu erzeugen (Abb. 6c).

a, Gen-Editing-Ergebnisse primärer menschlicher Hepatozyten, die mit mRNAs transfiziert wurden, die für CBE-T1.46 und BE4 an drei Stellen innerhalb des PCSK9-Gens kodieren (links, P = 0,2882 (NS); rechts, P = 0,0017 (Doppelsternchen)). Positionsänderung innerhalb des angegebenen Protospacers. b, Bewertung der relativen Veränderung der PCSK9-Sekretion zwischen Tag 9 (Sammelzeitpunkt) und Tag 0 (Transfektionszeitpunkt) durch ELISA. Die Ziel-PCSK9-Site ist auf der x-Achse angegeben. Die P-Werte sind wie folgt: Q555X im Vergleich zu unbehandelt, P = 0,001001 (doppeltes Sternchen); E4-Spleiß im Vergleich zu unbehandelt, P = 0,001295 (Doppelsternchen). c, Relative Veränderung des im Überstand vorhandenen LDL-R zwischen Tag 9 und Tag 0, ermittelt durch ELISA. Die P-Werte lauten wie folgt: Q555X gegenüber unbehandelt, P = 0,001116 (Doppelsternchen), E4-Spleiß gegenüber unbehandelt, P = 0,009481 (Doppelsternchen). d, Effizienz der Genbearbeitung durch sgRNA-Screenings in primären menschlichen T-Zellen unter Verwendung von CBE-Ts. Die Beschriftung der X-Achse gibt das Zielgen und die Zielbase innerhalb der sgRNA an. e,f, Prozentuale C·G-zu-T·A-Umwandlung (e) und Oberflächenproteinverlust (f), die von jedem Baseneditor oder jeder Kontrolle in multiplex-editierten primären menschlichen T-Zellen erreicht werden. Primäre Hepatozytendaten wurden aus n = 3 („keine“/unbehandelte Proben) oder 4 (BE4- und CBE-T1.46-Proben) unabhängigen biologischen Replikaten generiert. T-Zelldaten wurden von n = 2 unabhängigen Spendern generiert. Gegebenenfalls wurde die statistische Signifikanz über zweiseitige ungepaarte t-Tests berechnet: NS, P ≥ 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01.

Quelldaten

Als nächstes untersuchten wir die Anwendung von CBE-Ts auf das therapeutische T-Zell-Engineering. Autologe T-Zelltherapien, die aus TCRαβ-exprimierenden T-Zellen abgeleitet sind, sind bei der Behandlung einiger Krebsarten wirksam, obwohl die Herstellung dieser Zelltherapien auf Einzelpatientenbasis zu inkonsistenten Produkten, hohen Warenkosten und erheblichen Verzögerungen bei der Patientenbehandlung führen kann. Mithilfe der Genbearbeitung können universell kompatible T-Zelltherapien entwickelt werden, die aus einzelnen Spendern für die Behandlung vieler Patienten gewonnen werden27. Universell kompatible T-Zell-Therapien erfordern eine Multigen-Stummschaltung, um die Expression des T-Zell-Rezeptors zu eliminieren, um das Potenzial für eine Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (GvHD) zu verringern, und Bearbeitungsstrategien, um die Abstoßung der allogenen T-Zellen durch den Wirt zu reduzieren oder zu eliminieren28. Um festzustellen, ob CBE-Ts für die Bearbeitung von T-Zellen verwendet werden könnten, elektroporierten wir T-Zellen mit mRNA, die für CBE-Ts kodiert, und gRNAs, die auf Gene abzielten, die für Komponenten des T-Zell-Rezeptors B2M oder CIITA kodieren, und stellten fest, dass CBE-Ts vergleichbare oder nur vergleichbare Ergebnisse lieferten etwas geringere Bearbeitungseffizienz im Vergleich zu BE4-Kontrollen (Abb. 6d). Die Multiplex-CBE-T-Bearbeitung zeigte vergleichbare Bearbeitungseffizienzen im Vergleich zur Single-Plex-Bearbeitung, was zu entsprechenden Protein-Knockdown-Werten führte (Abb. 6e, f und ergänzende Abb. 31), was das Potenzial der CBE-T-Plattform für die Therapie demonstriert Zellulartechnik.

Hier beschreiben wir die Entwicklung von zwei Familien von Baseneditoren, CABE-Ts und CBE-Ts, die Varianten von TadA verwenden, um die Desaminierung von Cytosinen entweder mit Beibehaltung (CABE-Ts) oder Verlust (CBE-Ts) der Adenin-Desaminierung zu katalysieren.

Im Verlauf von insgesamt zehn Runden gerichteter Evolution und weiteren Runden strukturgesteuerten Designs ist TadA so ausgereift, dass es über 29 Substitutionen in unseren am häufigsten entwickelten CBE-Ts enthält (Abb. 3c). Durch Röntgenkristallographie zeigen wir, wie sich die Anhäufung von Substitutionen auf die Form des Hohlraums im aktiven Zentrum auswirkt und zur Aufnahme von Cytosin als Substrat und der anschließenden Verschiebung der Spezifität in Richtung C-zu-U-Desaminierung beitragen kann. Die hier entwickelten Strukturen veranschaulichen, wie Aminosäuresubstitutionen in TadA die in Zellen beobachteten Ergebnisse der Genbearbeitung beeinflussen.

Bei den hier gemeldeten CABE-Ts und CBE-Ts handelt es sich um Präzisions-Base-Editoren mit stark abgemilderten Guide-unabhängigen DNA-Off-Target-Ergebnissen, weniger Bystander-Bearbeitungen und weniger Guide-abhängigen DNA-Off-Targets im Vergleich zu zuvor berichteten CBEs aufgrund der unterschiedlichen Kinetik von Desaminierung von ssDNA durch die TadA-Variante, die in unseren CBE-T-Konstrukten verwendet wird. TadA-basierte CBE-Ts und CABE-Ts behalten eine hohe Bearbeitungsaktivität am Ziel bei und ermöglichen eine hohe Genbearbeitungseffizienz sowohl in Einzel- als auch in Multiplex-Anwendungen.

Schließlich zeigen wir, dass unsere CBE-Ts in therapeutisch relevanten Zelltypen, einschließlich primärer Hepatozyten und primären T-Zellen, aktiv sind, wobei die Bearbeitungsergebnisse denen mit BE4 ähnlich oder sogar überlegen sind. Wir demonstrieren die Fähigkeit von CBE-Ts, Zielstellen im PCSK9-Locus zu bearbeiten, um die Menge an sekretiertem PCSK9-Protein zu reduzieren und ein hohes Maß an multiplexer Bearbeitung an T-Zellzielen zu erreichen, die für die Erzeugung allogener CAR-T-Zellen relevant sind.

Zusammenfassend stellt die Entwicklung von TadA für den Einsatz bei der hocheffizienten Bearbeitung von Cytosinbasen einen bedeutenden Fortschritt in der Entwicklung von CBEs als therapeutische Instrumente dar. Zusammen mit ABEs ermöglichen CABE-Ts und CBE-Ts die programmierbare Installation aller DNA-Übergangsmutationen in lebenden Zellen, einzeln oder gleichzeitig, durch den Einsatz im Labor entwickelter und hochentwickelter TadA-Deaminasen und erweitern somit die potenziellen therapeutischen Anwendungen der Cytosinbase Bearbeitung.

Alle molekularbiologischen Methoden und Klonierungsschritte wurden wie zuvor beschrieben13 durchgeführt, einschließlich der Verwendung des USER-Enzyms (New England Biolabs, NEB, M5505L), des Phusion U DNA Polymerase Green Multiplex PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, F564L) und des Q5 Hot Start High -Fidelity 2X Master Mix (NEB, M0494L), Mach T1 kompetente Zellen (Thermo Fisher Scientific, C8681201) und ZymoPURE II Plasmid Midiprep Kits (Zymo Research Corporation, D4201) gemäß den Herstellerprotokollen. Aminosäuresequenzen für in dieser Studie hervorgehobene Baseneditoren finden Sie in den Ergänzungssequenzen 3–31. Sequenzen von sgRNAs, die zum Targeting genomischer Stellen verwendet werden, finden Sie in der Ergänzungstabelle 3. Repräsentative CABE-Ts und CBE-Ts, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden auf Addgene hinterlegt.

Synthetische Bibliotheken für die gerichtete Evolutionsrunde eins und zwei wurden von Ranomics mit den folgenden Spezifikationen erhalten: Evolutionsrunde eins TadA*8.20-Bibliothek – jede Aminosäureposition der TadA*8.20-Sequenz (von ABE8.20) muss durch alle 20 Aminosäuren repräsentiert werden Ersetzungen mit einer Häufigkeit von 1–3 Ersetzungen pro Bibliotheksmitglied (~10 Millionen Mitglieder). Diese Bibliothek schloss alle Stoppsequenzen aus und verwendete nur ein Codon pro Aminosäure. Diese synthetische Bibliothek wurde mit einer randomisierten Bibliothek kombiniert, die mit fehleranfälliger PCR unter Verwendung von TadA*8.19 (Lit. 13) als Matrize generiert wurde, wie zuvor in Lit. berichtet. 12. Evolution rund um die zweite synthetische Bibliothek – jede Aminosäureposition der TADAC1.02-Sequenz wird durch alle 20 Aminosäuresubstitutionen mit einer Häufigkeit von 2–3 Substitutionen pro Bibliotheksmitglied (~10 Millionen Mitglieder) repräsentiert. Diese Bibliotheken wurden durch USER-Klonierung in ein bakterielles Expressionsplasmid geklont, das totes Cas9 (dCas9 D10A und H840A) sowie gRNAs enthielt, die auf das Chloramphenicol-Resistenzgen abzielen.

Die gerichtete Evolution der TadA8.19- und TadA8.20-Bibliothek (gerichtete Evolution, Runde eins) und der TADAC1.02-Bibliothek (gerichtete Evolution, Runde 2) wurde wie zuvor in Lit. beschrieben durchgeführt. 13 mit den folgenden Änderungen: Bibliotheken verschiedener TadA*-Desaminase-Varianten, die in einem bakteriellen Plasmid enthalten sind, das die TadA*-dCas9-UGI-Editor-Architektur enthält, wurden herausgefordert, Änderungen im Chloramphenicol-Resistenzgen rückgängig zu machen, um die Behandlung mit tödlichen Dosen eines Antibiotikums zu überleben. In der ersten Runde der gerichteten Evolution war die Evolutionsbibliothek eine Kombination aus einer fehleranfälligen ABE8.19m TadA*-Bibliothek und einer synthetischen ABE8.20m TadA*-Bibliothek, in der jede Aminosäureposition durch alle 20 Substitutionen mit einer Häufigkeit von 1 dargestellt wird –3 Vertretungen pro Bibliotheksmitglied. Um die Antibiotika-Herausforderung zu bewältigen, waren zwei C-zu-T-Reversionen (Prolin-Reversion und His-Reversion im aktiven Zentrum) erforderlich. In der zweiten Evolutionsrunde wurde eine synthetische Bibliothek von CABE-T1.2 verwendet, die mit den Spezifikationen als ABE8.20 TadA*-Bibliothek, jedoch mit 2–3 Substitutionen pro Bibliotheksmitglied, generiert wurde. Um die Antibiotika-Herausforderung zu bewältigen, waren dieselben zwei C-zu-T-Reversionen plus zwei A-zu-G-STOP-Codon-Reversionen erforderlich.

HEK293T-Zellen (ATCC, CRL-3216) wurden in DMEM + GlutaMAX (Gibco, 10569), ergänzt mit 10 % (Vol./Vol.) fötalem Rinderserum (Gibco, 10437), bei 37 °C und 5 % CO2 gemäß Standardprotokollen kultiviert von ATCC und wie zuvor beschrieben.13

Für alle Transfektionen wurden HEK293T-Zellen 16–22 Stunden vor der Transfektion mit einer Dichte von 3,0 × 10 Zellen pro Vertiefung in BioCoat-Poly-D-Lysin-beschichtete Platten mit 48 Vertiefungen (Corning, 356509) ausgesät. Plasmidtransfektionen wurden unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) wie zuvor beschrieben durchgeführt.13 Transfektionen mit mRNA wurden unter Verwendung von Lipofectamine MessengerMAX gemäß den Herstellerprotokollen mit den folgenden Spezifikationen durchgeführt: 500 ng (für sättigende Bedingungen) oder 62,5 ng (untersättigende Bedingungen). Bedingungen) mRNA, die für Editor oder Kontrolle kodiert, und 100 ng synthetische gRNA wurden in 12,5 μl Gesamtvolumen serumreduziertem OptiMEM-Medium (Gibco, 31985) kombiniert. Anschließend wurde der mRNA/gRNA-Lösung eine 12,5 μl 1:12,5 (Lipo:OptiMEM) MessengerMAX-Mischung zugesetzt und der gesamte Inhalt 15 Minuten bei Umgebungstemperatur ruhen gelassen. Für mRNA-Transfektionen bei untersättigten Bedingungen wurden außerdem 437,5 ng Träger-mRNA hinzugefügt, um äquivalente Mengen an transfiziertem Material aufrechtzuerhalten. Die gesamte 25-μl-Mischung wurde dann zur Behandlung der vorgeimpften HEK293T-Zellen verwendet. Die in dieser Studie verwendeten Sequenzen der sgRNAs sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. Synthetische gRNAs für mRNA-Transfektionen weisen 5′/3′-Endmodifikationen auf, wie zuvor beschrieben.13

Nach 4-tägiger Inkubation wurde gDNA aus HEK293T-Zellen unter Verwendung von 100 μl Quick Extract DNA Extraction Buffer (Lucigen, QE09050) gemäß den Herstellerprotokollen aus den Zellen geerntet. Für allogene T-Zellen wurden 5–6 Tage nach der Transfektion 50 μl Quick Extract DNA Extraction Buffer auf 1 × 105 Zellen verwendet. Genomische DNA-Proben aus Säugetierzellproben wurden mit Primern für die ortsspezifische genomische DNA-Amplifikation amplifiziert, die Adaptersequenzen enthielten, die mit dem TruSeq HT-System von Illumina kompatibel waren (Adapter Read 1-Sequenz, AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA; Adapter Read 2, Sequenz AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT). Die Sequenzen dieser Primer sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Konkret wurden 2 μl gDNA zu einem PCR-Reaktionsgemisch gegeben, das Phusion U Green Multiplex Master Mix (Thermo Fisher Scientific, F564L) und 0,5 μM jedes Vorwärts- und Rückwärtsprimers enthielt. Diese Amplikons wurden dann mit dem Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix mit einem Barcode versehen, wobei 2 μl Amplikon aus der ersten PCR-Runde zum Mastermix hinzugefügt wurden, der 0,5 μM jeder einzigartigen Kombination aus Vorwärts- und Rückwärts-Barcode-Primer enthielt. Die Thermocycling-Bedingungen sind wie folgt: 95 °C × 2 Minuten anfängliche Denaturierung; 95 °C × 15 s Zyklusdenaturierung; 62 °C × 20 s Glühen; 72 °C × 20 s Verlängerung, mit Zykluswiederholungen von 30 für die anfängliche Amplikon-Generierung und 10 für die Barcodierung. Mit Barcodes versehene Amplikons wurden gereinigt, ihre Größe mittels Gelelektrophorese ausgewählt und mit dem Qiaquick Gel Extraction Kit (Qiagen, 28706×4) gelextrahiert, und die resultierenden DNA-Konzentrationen wurden mit einem NanoDrop 1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific) bewertet.

Alle gezielten Amplikon-NGS-Daten wurden mit den zuvor beschriebenen Methoden analysiert, einschließlich der Verwendung der folgenden Tools/Software: trimmomatic (v0.39), bowtie2 (v2.35), samtools (v1.9) und bam-readcounts (v0.8). ).13

FASTQ-Dateien wurden mithilfe von BWA mem2 (bwa-mem2-2.2.1) an das menschliche Genom (Gencode GRCh38v31-Primärassembly) angepasst. Ausrichtungen wurden nach Koordinaten sortiert, bei Bedarf zusammengeführt und Duplikate mit Picard (v2.21.7) in den Standardeinstellungen markiert. Anschließend wurde eine Neukalibrierung des Basisqualitätsfaktors mit GATK (v4.1.4.1) durchgeführt, um eine BAM-Datei zur Eingabe in LoFreq (v2.1.5) zum Variantenaufruf zu erstellen. Massenprobe 1 wurde als Normalprobe verwendet und jede klonal expandierte Zelle wurde als separate Tumorprobe untersucht, um für jede Zelle spezifische somatische Mutationen zu identifizieren. LoFreq wurde mit dem Flag „–min-cov 10“ ausgeführt, um eine mindestens zehnfache Abdeckung an der Variantenstelle zu erfordern, und somatische Varianten wurden aus der Ausgabedatei somatic_final_minus-dbsnp.snvs analysiert, um häufige Varianten zu entfernen, bei denen es sich wahrscheinlich um Fehlalarme handelte.

Für die Odds-Ratio-Diagramme ist eine einzelne repräsentative Zelle der unbehandelten klonal expandierten Zellen als Referenzpunkt für den Vergleich mit den behandelten und unbehandelten Zellen sowohl für C-zu-T- als auch A-zu-G-Desaminierungen erforderlich. Diese Zelle wurde ausgewählt, indem die unbehandelten Zellen nach dem Anteil der A-zu-G-Mutationen und dem Anteil der C-zu-T-Mutationen geordnet wurden und die Zelle ausgewählt wurde, die dem Median für beide Metriken am nächsten kam. N1 befand sich an Position 5/8 für C-zu-T-Mutationen und an Position 3/8 für A-zu-G-Mutationen, was es zum besten Kandidaten für die Referenzzelle sowohl bei CABE-T- als auch bei CBE-T-Behandlungen macht.

Das TadA*8.20-Protein wurde in einen pET51b+-Vektor mit His- und SUMO-Tags am N-Terminus kloniert und in E. coli BL21 Star (DE3)-Zellen (NEB, C2527I) in LB-Medien exprimiert. Zellkulturen wurden bei 37 °C unter Schütteln mit 240 U/min gezüchtet und die Proteinexpression wurde durch 0,5 mM IPTG induziert, als die OD600 0,6 erreichte. Die Zellkultur wurde unter Schütteln über Nacht bei 18 °C inkubiert. Geerntete Zellen wurden durch einen Hochdruckhomogenisator in Lysepuffer (25 mM Bis-Tris, 500 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 6,0 und 1 mM PMSF) lysiert und das Zelllysat hergestellt durch Ultrazentrifugation geklärt. Geklärte Lysate wurden durch Batch-Bindung für 1 Stunde bei 4 °C auf Ni-NTA-Agaroseharz geladen. Das Harz wurde mit Lysepuffer mit 20 mM Imidazol auf einer Schwerkraftflusssäule gewaschen, gefolgt von der Elution mit dem Lysepuffer, ergänzt mit 50/100/250 mM Imidazol. Die eluierte Probe wurde mit Ulp1 inkubiert und über Nacht in 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin und pH 6,0 dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf Ni-NTA-Harz geladen, um ungespaltenes Protein und Ulp1 zu entfernen. Der Durchfluss von umgekehrtem Ni-NTA wurde auf eine 5-ml-Heparin-HP-Säule (Cytiva) geladen und unter Verwendung eines 0–2 M NaCl-Gradienten eluiert. Fraktionen, die TadA*8.20-Protein enthielten, wurden durch Größenausschlusschromatographie auf Superdex75 10/300 in 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 7,0 weiter gereinigt. Das TADAC-1.14-Protein wurde mit dem N-terminalen His-Tag im pET51b+-Vektor exprimiert und wie oben beschrieben gereinigt, mit der Ausnahme, dass die Ulp1-Tag-Spaltung und die umgekehrten Ni-NTA-Schritte weggelassen wurden. TADAC-1.17 und TADAC-1.19 wurden in den pD881-Vektor (ATUM) mit N-terminalem His-Tag und SUMO-Tag kloniert und in E. coli BL21-Zellen (NEB) exprimiert. Die Proteinexpression wurde durch 0,2 % (Gew./Vol.) Rhamnose bei einer OD600 von 0,6 induziert, gefolgt von einer 4-stündigen Inkubation bei 37 °C. Die Reinigung wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Diese Desaminase-Varianten wurden für Röntgenkristallographiestudien verwendet. Alle für biochemische Studien verwendeten CBE-T-Base-Editor-Proteine ​​wurden wie oben beschrieben mit geringfügigen Modifikationen exprimiert und gereinigt.

Die Kristallisationsbedingungen von TadA*8.20 mit ssDNA, die das Adeninanalogon 2-Desoxy-8-azanebularin (d8Az), 5′-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) enthält )C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11) G(12)A(13)-3′, wurde mit einem Mosquito-Roboter (SPT LabTech) bei 20 °C identifiziert und optimiert. Tropfen wurden durch Mischen von 1 μl Protein plus ssDNA-Lösung (0,15 mM TadA*8,20 in 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 7 und 0,22 mM ssDNA mit d8Az hergestellt ) und 1 μl Reservoirlösung (27–29 % (Vol./Vol.) PEG 3.350, 0,22–0,26 M Ammoniumacetat, 0,1 M Tris pH 8,5) und äquilibriert gegen 70 μl Reservoirlösung. Die Kristalle wurden in eine Kryoschutzmittellösung (15 % (Vol./Vol.) Glycerin, 29 % (Vol./Vol.) PEG 3.350, 0,26 M Ammoniumacetat, 0,1 M Tris pH 8,5) überführt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Die Kristallisationsbedingungen von TADAC-1.17 mit ssDNA, die das Adeninanalogon 2-Desoxy-8-azanebularin (d8Az), 5′-G(1)C(2)T(3)C(4)G(5)G(6) enthält )C(7)T(8)d8Az(9)C(10)G(11) G(12)A(13)-3′, wurde mit einem Mosquito-Roboter (SPT LabTech) bei 20 °C identifiziert und optimiert. Tropfen wurden durch Mischen von 1 μl Protein plus ssDNA-Lösung (0,15 mM TADAC-1.17 in 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 7 und 0,22 mM ssDNA mit d8Az hergestellt ) und 1 μl Reservoirlösung (4–8 % (Vol./Vol.) PEG 3.350, 8–10 % Tacsimate pH 6) und äquilibriert gegen 200 μl Reservoirlösung. Die Kristalle wurden in eine Kryoschutzmittellösung (12 % (Vol/Vol) PEG 3.350, 10 % (Vol/Vol) Tacsimate pH 6, 25 % (Vol/Vol) Glycerin) überführt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Die Kristallisationsbedingungen von TADAC-1.14 ohne ssDNA (TADAC-1.14-Holo) wurden mithilfe eines Mosquito-Roboters (SPT LabTech) bei 20 °C identifiziert und optimiert. Tropfen wurden durch Mischen von 1 μl Proteinlösung (0,18 mM TADAC-1.14 in 25 mM Bis-Tris, 450 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 7) und 1 μl Reservoirlösung ( 1,8–2,0 M Ammoniumsulfat, 0,1 M HEPES pH 7,5) und gegen 200 μl Reservoirlösung äquilibriert. Die Kristalle wurden in eine Kryoschutzmittellösung (1,8 M Ammoniumsulfat, 0,1 M HEPES pH 7,5, 20 % (Vol./Vol.) Glycerin) überführt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Die Kristallisationsbedingungen von TADAC-1.19 ohne ssDNA (TADAC-1.19-Holo) wurden mithilfe eines Mosquito-Roboters (SPT LabTech) bei 20 °C identifiziert und optimiert. Tropfen wurden durch Mischen von 1 μl Proteinlösung (0,3 mM TADAC-1.19 in 25 mM Bis-Tris, 300 mM NaCl, 1 mM TCEP, 10 % (Vol./Vol.) Glycerin, pH 7) und 1 μl Reservoirlösung ( 6–12 % (Vol./Vol.) PEG 3.350, 0,3–0,5 M Ammoniumcitrat tribasisch pH 7,0) und gegen 200 μl Reservoirlösung äquilibriert. Die Kristalle wurden in eine Kryoschutzmittellösung (16 % (Vol./Vol.) PEG 3.350, 0,6 M tribasisches Ammoniumcitrat, pH 7,0, 20 % (Vol./Vol.) Glycerin) überführt und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt.

Die Datenerfassungen wurden an der Frontier Microfocusing Macromolecular Crystallography (FMX)-Beamline der National Synchrotron Light Source II oder der ID30B-Beamline der European Synchrotron Radiation Facility oder der BL13-XALOC-Beamline des ALBA-Synchrotrons oder der P13-Beamline des EMBL Hamburg durchgeführt am Speicherring PETRA III (DESY). Beugungsdaten wurden mit XDS29 verarbeitet und mit AIMLESS30 skaliert. Die Kristallstrukturen von TadA*8.20, TADAC-1.17, TADAC-1.14 und TADAC-1.19 ohne oder mit ssDNA wurden durch in Phaser31 implementierte molekulare Ersatztechniken bestimmt. Für die TadA*8.20-Struktur wurden die Koordinaten der E. coli TadA-Struktur (Protein Data Bank (PDB)-Code: 1Z3A)32 verwendet, um die Anfangsphasen zu erhalten. Für TADAC-1.17-, TADAC-1.14- und TADAC-1.19-Strukturen wurden die Koordinaten von TadA*8.20 (diese Studie) verwendet, um die Anfangsphasen zu erhalten. Nach dem Molekülaustausch wurde in phenix.refine33 ein simuliertes Annealing durchgeführt, um Modellverzerrungen zu beseitigen. Die Modelle wurden durch iterative Modellbildungsrunden und die Hinzufügung von Wassermolekülen mithilfe von Coot34 verfeinert. Zur Verfeinerung der Strukturen in phenix.refine wurden nichtkristallographische Symmetriebeschränkungen, Positions- und B-Faktor-Verfeinerung sowie TLS (Translation, Libration und Schraube) verwendet (außer TADAC-1.17 und TADAC-1.14). Die Kristalle von TadA*8.20 und TADAC-1.17 sind gemäß Britton-Analysen (phenix.xtriage) meroedrisch verzwillingt mit Zwillingsanteilen von 0,375 bzw. 0,246, und das Zwillingsgesetz -h,-k,l wurde zur Verfeinerung verwendet. Die Datenerfassungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in der Ergänzungstabelle 2 zusammengefasst. Die in den Strukturen sichtbaren Reste und Nukleotide von 167 Resten und 13 Nukleotiden sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt. Die Abbildungen wurden mit PyMol Software erstellt (Schrödinger, 2010. The PyMOL Molecular Grafiksystem, Version 2.4.1.).

Die sgRNA (mG*mA*mA*CACAAAGCAUAGACUGCGUUUUAGAGCUAGAAAAUAGC

AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU; Modifikationen: m, 2′-O-Methyl und *, Phosphorothioat-Verknüpfung) wurde bei Agilent Technologies und Integrated DNA Technologies (IDT) synthetisiert. Substrat-DNA wurde bei IDT synthetisiert: Der DNA-Strang, der einer Desaminierung unterzogen wurde (TTCGGTGGCTCCGTCCGTGAACACAAAGCATAGACTGCCGGCGTTTTGGTTGCTCTTCG), wurde mit dem 5'-ATTO-647-Fluorophor markiert, und ein komplementärer DNA-Strang, der einem Nicking durch D10A-Nickase unterzogen wurde (CGAAGAGCAACCAAAACGCCGGCAGTCTATGCTTTGTGTTCACGGACGGAGCCACCGAA), wurde mit markiert 5′ 6-FAM-Fluorophor. Für die RNA-unabhängige Desaminierung wurde die mit ATTO-647 markierte Einzelstrang-DNA unverändert verwendet. Für die Guide-RNA-abhängige Desaminierung wurde dsDNA-Substrat durch Annealing der beiden Stränge hergestellt, wobei der zweifache Überschuss des Strangs einem Nicking unterzogen wurde (1:2 nmol). Die doppelsträngige DNA wurde durch 7,5 % native PAGE (29:1, Acrylamid:Bisacrylamid; Sigma) gereinigt. Die die dsDNA enthaltende Acrylamidbande wurde herausgeschnitten, zerkleinert und über Nacht in Crush-and-Soak-Puffer (400 mM NaCl und 25 mM EDTA) rotiert, um die dsDNA zu eluieren. Die eluierte dsDNA wurde nach Zugabe von 1 Volumen 100 % 2-Propanol 2 Stunden lang bei –20 °C präzipitiert, gefolgt von einer 30-minütigen Zentrifugation bei 20.000 g bei 4 °C. Das DNA-Pellet wurde mit 1 Volumen 70 % Vol/Vol Ethanol gewaschen und 30 Minuten lang bei 4 °C und 20.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur luftgetrocknet und in Wasser resuspendiert.

RNP-Komplexe wurden durch Mischen der sgRNA und des entsprechenden Base-Editor-Proteins in einem molaren Verhältnis von 1,5:1 in „RNP-Assemblierungs- und Reaktionspuffer“ (20 mM HEPES-KOH pH 7,4, 100 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 % Vol.) gebildet. Vol. Glycerin, 2 mM TCEP) und 20-minütiges Inkubieren bei Raumtemperatur.

Für die Single-Turnover-Kinetik der Guide-RNA-abhängigen dsDNA-Desaminierung in vitro wurde bis zu einer RNP-Endkonzentration von 1 µM eine Endkonzentration von 10 nM dsDNA-Substrat (zubereitet bei 100 nM in RNP-Zusammenbau und Reaktionspuffer) hinzugefügt, um die Desaminierung zu initiieren. Die Reaktion wurde bei 37 °C inkubiert und Aliquote von 5 µl wurden in den angegebenen Zeitintervallen entnommen. Die Reaktionen wurden in 50 µl Löschpuffer (50 mM Tris-Cl, pH 8,5, 400 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,1 % SDS, 1 µl thermolabile Proteinase K (New England Biolabs, NEB P8111S) und 1 µl 15 mg gequencht ml−1 Kopräzipitationsmittel Glycoblue (Thermo Fisher Scientific, A9515)) für 15 Minuten bei 37 °C. Die thermolabile Proteinase K wurde 15 Minuten lang bei 75 °C inaktiviert.

Die abgeschreckten Reaktionszeitpunkte wurden dann wie oben beschrieben mit 2-Propanol ausgefällt. Zum Nachweis von durch ABEs katalysiertes desaminiertes Adenin (Inosin) wurden die präzipitierten Zeitpunkte mit Endonuklease V behandelt, wie zuvor in Lit. beschrieben. 20,35. Zum Nachweis von desaminiertem Cytidin (Desoxyuridin), das durch CBEs katalysiert wird, wurden die präzipitierten Zeitpunkte gemäß den Herstellerrichtlinien mit USER II (NEB, M5508L) behandelt. Die Proben wurden mit dem gleichen Volumen Formamid-Gelladepuffer (95 % Formamid, 25 mM EDTA, 0,025 % SDS und 0,025 % Bromphenolblau) gemischt, 5 Minuten lang auf 98 °C erhitzt und auf der denaturierenden 7,5 % Harnstoff-PAGE (19) aufgelöst :1, Acrylamid:Bisacrylamid; National Diagnostics). Die Reaktion wurde durch sequentielles Scannen des Gels mit FAM und anschließenden Alexa-647-Einstellungen mit dem ChemiDoc Imaging System (Bio-Rad) überwacht. Die Intensitäten der ungespaltenen und gespaltenen DNA wurden mit ImageJ 1,53 K quantifiziert. Die Daten wurden an einen einzelnen exponentiellen Zerfall in Prism 9 (GraphPad Prism, v9.4.0) angepasst, um die scheinbaren Desaminierungsraten (kapp) zu berechnen. Das bei allen untersuchten Baseneditoren konstante Nicking der Substrat-DNA durch D10A-Nickase des Baseneditors wurde mit dem 6-FAM-Fluorophor nachgewiesen und als Kontrolle verwendet, um einheitlich aktive rekombinante Proteine ​​sicherzustellen.

Für die Single-Turnover-Kinetik der Guide-RNA-unabhängigen ssDNA-Desaminierung in vitro wurde die Reaktion wie oben beschrieben aufgebaut, jedoch mit den folgenden Modifikationen: Der Baseneditor war nicht mit sgRNA programmiert und wurde mit dem ATTO-647-markierten ssDNA-Strang inkubiert.

Für den In-vitro-Endpunkt-Desaminierungstest zum Vergleich der Desaminierung durch ABE 8.20, BE4, CABE-T2.17, CABE-T3.155, CBE-T1.14 und CBE-T1.52 wurde die Desaminierungsreaktion mit 1- µM BE RNP und 10 nM dsDNA-Substrat wie oben beschrieben. Anstelle der Zeitpunkte wurde die gesamte Reaktion nach 24 Stunden gestoppt und wie oben beschrieben ausgefällt. Die ausgefallene Reaktion wurde in Wasser resuspendiert und in vier gleiche Teile aufgeteilt: unbehandelt, behandelt mit Endonuklease V wie beschrieben, behandelt mit USER II wie beschrieben und behandelt mit menschlicher Alkyladeninglycosylase (hAAG; NEB 0313S), gefolgt von AP-Endonuklease 1 (APE1; NEB M0282L) gemäß Herstellerangaben. Die Kombination von hAAG und APE1 wurde aufgrund unserer experimentellen Beobachtung verwendet, dass G:U (Produkt der Cytosin-Desaminierung) ein Substrat für EndoV ist, was von NEB bestätigt wurde (https://www.neb.com/tools-and-resources). /selection-charts/dna-repair-enzymes-on-damaged-and-non-standard-bases). EndoV konnte daher beim Vergleich von ABEs, CABEs und CBEs für relative A-zu-I- und C-zu-U-Desaminierungsaktivitäten nicht verwendet werden. hAAG ist spezifischer und produzierte unter denselben experimentellen Bedingungen nur ein nachweisbares Spaltprodukt für die A-zu-I-Desaminierung, nicht jedoch für die C-zu-U-Desaminierung und wurde daher für solche Vergleiche verwendet. Nach diesen Behandlungen wurden die Proben auf Harnstoff-PAGE aufgetrennt und die Daten wie oben beschrieben quantifiziert.

Die in dieser Studie verwendeten mRNAs wurden durch In-vitro-Transkription von Expressionsplasmiden hergestellt, die für unsere Editoren und Kontrollen kodieren, gemäß den zuvor in Lit. beschriebenen Protokollen. 13.

HEK293T-Zellen wurden über Lipofectamine MessengerMAX (Thermo Fisher Scientific, LMRNA001) mit Kontroll- (Cas9, SPACE usw.) oder Editor-kodierender mRNA zusammen mit synthetischer gRNA (Sonderbestellung von Axolabs) transfiziert, die auf eine Region in β-2-Mikroglobulin (B2M) abzielt ). Die Reihenfolge dieses synthetischen Leitfadens ist wie folgt (Axolabs-spezifische Syntax): ascsusCACGCUGGAUAGCCUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGGUGCusususU

Die Unterbrechung von B2M bei erfolgreichem Targeting durch ABE, CBE oder Cas9 an dieser Site wurde intern validiert. Drei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit TrypLE Express dissoziiert, mit Zellfärbepuffer (Biolegend, 420201) durch Zentrifugation gewaschen und in Zellfärbepuffer, der 1:100 PE-konjugierten antihumanen B2M-Antikörper (Biolegend, 316306) enthielt, resuspendiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis im Dunkeln wurden die Zellen dreimal mit Zellfärbepuffer durch Zentrifugation gewaschen und in standardmäßige 5-ml-FACS-Röhrchen abgeseiht.

Als PE-negativ eingestufte Einzelzellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen sortiert, die DMEM + 20 % FBS + 100 Einheiten pro ml Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15140122) enthielten. Für die unbehandelte Kontrolle wurden einzelne Zellen nur nach Lebendzellen sortiert. Repräsentative Gating-Strategien sind in der ergänzenden Abbildung 30 dargestellt. Nach 12 Tagen Kultur wurde gDNA mit dem Agencourt DNAdvanced Kit (Beckman-Coulter, A48705) gemäß den Herstellerprotokollen aus Zellen geerntet. Die Bestätigung der erfolgreichen Bearbeitung jedes Klons wurde durch gezielte Amplikonsequenzierung des B2M-Amplikons erreicht, das die Zielstelle umfasst. Die sequenzbestätigte gDNA wurde dann zur Bibliotheksvorbereitung und WGS an Novogene übermittelt.

Menschliche T-Zellen wurden aus Leukaphereseprodukten (Leukopaks, HemaCare) durch positive Selektion unter Verwendung von CD4- und CD8-MicroBeads (Miltenyi, 130045101 und 130045201) isoliert. T-Zellen wurden mit 25–50 × 106 Zellen pro ml Cryostor CS10 (Stemcell Technologies, 1001061) eingefroren. Für Editierungsexperimente wurden T-Zellen in einem Wasserbad bei 37 °C aufgetaut und dann über Nacht in ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium ruhen gelassen, das (Stemcell Technologies, 10981) 5 % CTS Immune Cell SR, Glutamax, 10 mM HEPES, 1 % Penicillin/Streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15140122). Am nächsten Tag wurden T-Zellen mit 25 μl ImmunoCult Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator (Stemcell Technologies, 10970) pro ml Zellen bei 1 × 106 Zellen pro ml plus 300 IU ml-1 IL-2 aktiviert ( CellGenix, 1420050). Alle 2–3 Tage wurde den T-Zellen frisches IL-2 zugesetzt. T-Zellen wurden bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.

T-Zellen wurden 72 Stunden nach der Aktivierung transfiziert. Die Zellen wurden in P3 Primary Cell Nucleofector Solution, enthaltend Supplement 1 (Lonza, V4SP-3960), resuspendiert. 1 × 106 T-Zellen wurden mit 1 μg synthetischer sgRNA (IDT) und 2 μg Editor-mRNA in einem Gesamtvolumen von 20 μl unter Verwendung des P3 96-Well Nucleocuvette Kit (Lonza, V4SP-3960) editiert. Die drei verwendeten sgRNAs sind wie folgt: B2M Exon 2 (B2M Ex.2), pmSTOP C6, CD247 pomSTOP C7 und PD-1 Ex.1 SA C7 sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben. T-Zellen wurden mit dem 4D-Nucleofector-System elektroporiert (Lonza, AAF-1003B und AAF-1003S) mit dem Programm DH-102. Alle Experimente wurden mit zwei unabhängigen T-Zellspendern durchgeführt. Für die NGS-Analyse wurden zu jedem Zeitpunkt 1 × 105 T-Zellen pro Bedingung pelletiert, der Überstand entfernt und die Pellets in 50 ml QuickExtract-DNA-Extraktionspuffer (Lucigen, QE09050) resuspendiert und zur gezielten Amplikonsequenzierung auf eine PCR-Platte übertragen.

Der Protein-Knockout wurde 5–6 Tage nach der Bearbeitung durch Durchflusszytometrie bewertet. T-Zellen wurden mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern für TCRα/β (Biolegend, 306718), β2M (Biolegend, 316304) und PD-1 (Biolegend, 367422) über eine 1:33-Verdünnung in Standard-PBS gefärbt. Für die PD-1-Analyse mittels Durchflusszytometrie wurden T-Zellen vor der Färbung über Nacht mit Cell Activation Cocktail (ohne Brefeldin A) (Biolegend) behandelt. Ereignisse wurden mit einem MACSQuant Analyzer 16 (Miltenyi) erfasst. Die Daten wurden mit der FlowJo-Software (v10.8.1) analysiert.

Kryogen gefrorene primäre menschliche Hepatozyten (BioIVT) wurden aufgetaut und mit einer Dichte von 3,5 × 105 Zellen pro Vertiefung auf BioCoat Collagen I-Platten mit 24 Vertiefungen (Corning, 354408) ausplattiert und entsprechend in CP-Medium, ergänzt mit Torpedo Antibiotic Mix (BioIVT), aufbewahrt mit Protokollen von BioIVT. Sobald PHH-Monokulturen über Nacht etabliert waren, umfasste die Erzeugung langlebiger PHH-Kulturen die zusätzliche Kokultivierung von murinen 3T3-J2-Fibroblasten (Kerafast, EF3003) mit 2,0 × 104 Zellen pro Vertiefung zu den etablierten PHH-Monokulturen. PHH-Kokulturen wurden während der gesamten Dauer der Studie alle 48 Stunden mit Medienwechseln aufrechterhalten.

PHH-Kokulturen wurden 48 Stunden nach der Erzeugung der Kokultur mit murinen 3T3-J2-Fibroblasten transfiziert. Transfektionen mit mRNA wurden unter Verwendung von Lipofectamine MessengerMax (Thermo Fisher Scientific, LMRNA003) gemäß den Protokollen des Herstellers mit den folgenden optimierten Spezifikationen durchgeführt: 1 µg (für Sättigungsbedingungen) mRNA, die für Editor kodiert, und 333 ng synthetische gRNA (Synthego). kombiniert in 30 µl serumreduziertem OptiMEM-Medium (Gibco, 31985). Eine 30-µl-Mischung im Verhältnis 1:15 (Lipofectamin:OptiMEM) wurde zur mRNA/gRNA-Lösung gegeben und die resultierende Endmischung 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur ruhen gelassen. Die gesamte 60-µl-Lösung wurde zur Behandlung einer Vertiefung mit kokultivierten primären menschlichen Hepatozyten verwendet. Jede Studienbedingung wurde dreifach durchgeführt und die verwendeten Transfektionsmengen wurden entsprechend erhöht. 9 Tage nach der Transfektion wurden die PHH-Kokulturen mit einer Lösung aus 10 mM Tris-HCl pH 8,0 (Thermo Fisher Scientific, 15568025), 0,05 % SDS (Thermo Fisher Scientific, 15553027) und 500 µg Proteinase K (Thermo Fisher) lysiert Scientific, EO0491) mit insgesamt 200 µl pro Vertiefung. Nach der Lyse wurde das Lysat 15 Minuten lang bei 85 ° C behandelt, um Proteinase K zu inaktivieren. Die in dieser Studie verwendeten Sequenzen der sgRNAs sind in der Ergänzungstabelle 3 angegeben.

Die Quantifizierung des PCSK9-Protein-Knockdowns wurde mit einem Human PCSK9 SimpleStep ELISA-Kit (Abcam, ab209884) bewertet, indem die sekretierte PCSK9-Konzentration im alle 48 Stunden gesammelten Überstand gemessen wurde. Der Überstand wurde mit Testpuffer zehnfach verdünnt und das Testprotokoll wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die LDL-R-Quantifizierung wurde mithilfe eines Human LDL-R SimpleStep ELISA-Kits (Abcam, ab209884) bewertet, indem das sekretierte LDL-R-Protein im alle 48 Stunden gesammelten Überstand gemessen wurde. Beide SimpleStep ELISA-Kits verwenden einen mit einem Affinitäts-Tag markierten Capture-Antikörper und einen Reporter-konjugierten Detektor-Antikörper. Der Fänger-Antikörper und der Detektor-Antikörper binden an Probenanalyten, die dann an einem Anti-Tag-Antikörper immobilisiert werden, der die Testvertiefung beschichtet. Beide kolorimetrischen ELISA-Tests werden bei einer Absorption von 450 nm gemessen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzierungsdaten der nächsten Generation, die allen Experimenten zugrunde liegen, werden im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter dem Einreichungsprojekt PRJNA869750 hinterlegt. Die Atomkoordinaten und Strukturfaktoren sind im PDB als Einträge hinterlegt: 8E2P, 8E2Q, 8E2R und 8E2S. Für die Abbildungen liegen Quelldaten vor. 1, 3–6, Erweiterte Daten Abb. 5–7 und ergänzende Abbildungen 2–4, 6, 15, 17–21, 22–29 (einschließlich Gelbild-Quelldateien). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Alle für die Datenanalyse verwendeten Softwaretools sind öffentlich verfügbar und wurden auf die zuvor in Lit. beschriebene Weise verwendet. 13.

Komor, AC, Kim, YB, Packer, MS, Zuris, JA & Liu, DR Programmierbare Bearbeitung einer Zielbase in genomischer DNA ohne doppelsträngige DNA-Spaltung. Natur 533, 420–424 (2016).

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Referenzen herunterladen

Wir danken M. Humes und B. Gantzer (Beam Tx) für die Unterstützung bei der Automatisierung. Wir danken J. Decker und David Born (Beam Tx) für NGS und rechnerische Unterstützung. Wir danken R. Manoukian und L. Hardy (Beam Tx) für ihre FACS-Expertise und für die Sortierung von Zellen, die in WGS-Experimenten verwendet werden. Wir danken A. Arvind (Beam Tx) für ihre Unterstützung bei der Proteinkristallisation.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Dieter K. Lam, Patricia R. Feliciano.

Beam Therapeutics, Cambridge, MA, USA

Dieter K. Lam, Patricia R. Feliciano, Amena Arif, Tangis Bohnuud, Thomas P. Fernandez, Jason M. Gehrke, Phil Grayson, Kin D. Lee, Manuel A. Ortega, Courtney Sawyer, Noah D. Schwaegerle, Leila Peraro, Lauren Young, Seung-Joo Lee, Giuseppe Ciaramella und Nicole M. Gaudelli

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DKL, PRF, AA und MAO führten gezielte Evolutions-, Struktur-, biochemische und Gen-Editing-Experimente durch und verfassten das Manuskript. CS, NS und KDL führten Experimente durch. TPF, JMG und LP führten Primärzellenexperimente durch, analysierten Daten und verfassten das Manuskript. TB, PG und LY analysierten Sequenzierungsdaten und führten statistische Analysen durch. S.-JL leitete Arbeiten in den Bereichen Strukturbiologie, Biochemie und Protein-Engineering und verfasste das Manuskript. GC hat das Manuskript bearbeitet. NMG konzipierte und leitete die Forschung und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Nicole M. Gaudelli.

Alle Autoren waren zum Zeitpunkt der Durchführung der Arbeit Mitarbeiter von Beam Therapeutics und sind Anteilseigner des Unternehmens. Beam Therapeutics hat für diese Arbeit Patentanmeldungen eingereicht.

Nature Biotechnology dankt Sangsu Bae und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Das obere Feld zeigt die durch TadA katalysierte hydrolytische Desaminierung von Adenosin. Das untere Feld zeigt die Hydratation des Adeninanalogs 2'-Desoxy-8-azanebularin (d8Az), das das Übergangszustandsanalogon bildet, das durch Koordination mit Zink im aktiven Zentrum eingefangen wird. b, Die Gesamtstruktur des funktionellen Homodimers TadA*8.20 (Kette A in Dunkelgrün; Kette B in Hellgrün), gebunden an ssDNA (gelb). c, Die Gesamtstruktur des TadA*8.20-Monomers. Das Monomer (hellgrün) enthält fünf β-Stränge (β1 bis β5) und sechs α-Helices (α1 bis α6), die sich zu einer einzigen Domäne mit einem zentralen fünfsträngigen β-Faltblatt falten, das von α-Helices umgeben ist. Das Zinkion wird als graue Kugel dargestellt. d, aktives Zentrum von TadA*8.20 mit gebundenem ssDNA-d8Az-Übergangszustandsanalogon. Das katalytische Zinkion (grau) ist an einen Histidinrest (H57), zwei Cysteinreste (C87 und C90) und das d8Az-Übergangszustandsanalogon (gelb) koordiniert. Die Wasserstoffbrückenbindungen werden als graue gestrichelte Linien dargestellt. e: Die Oberfläche des TadA*8.20-Dimers (dunkel- und hellgrün), gebunden an ssDNA (gelb), was zeigt, dass ssDNA im tiefen Hohlraum des aktiven Zentrums an der Protein-Dimer-Grenzfläche gebunden ist und mit Resten beider Monomere, einschließlich der Substitutionen, interagiert I76Y, L84F, D108N, R152P, E155V und I156F im Vergleich zum Wildtyp-TadA. Die Substitutionen an der Proteinoberfläche werden in Orange angezeigt (W23R, H36L, R51L, I76Y und A106V), am C-Terminus in Rosa (S146C, D147R, R152P, Q154R, E155V, I156F und K157N) und an der aktives Zentrum in Cyan (P48A, V82S, L84F und D108N). f, Wechselwirkungen zwischen ssDNA (gelb) und TadA*8.20-Resten im aktiven Zentrum. Die Reste der Ketten A und B sind jeweils dunkel- und hellgrün dargestellt. Die Proteinoberfläche, der C-Terminus und die Substitutionen im aktiven Zentrum sind jeweils in Orange (Kette A), Rosa (Kette B) und Cyan (Kette B) dargestellt. Das Zinkion wird in einer grauen Kugel dargestellt. Die Wasserstoffbrückenbindungen sind als schwarze gestrichelte Linien dargestellt. Eine Stereoansicht ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt.

Quelldaten

a, Die Gesamtstruktur des funktionellen TADAC-1.17-Homodimers (Kette A in Dunkelblau; Kette B in Schieferblau) mit gebundener ssDNA (gelb). Die Substitutionen (T17A, A48G, S82T und A142E) relativ zu TadA*8.20 sind in cyanfarbenen Kugeln dargestellt. b, Die Gesamtstruktur des TADAC-1.17-Monomers (schieferblau) in einem Komplex mit ssDNA (gelb). Das Monomer enthält fünf β-Stränge (β1 bis β5) und sechs α-Helices (α1 bis α6), die sich zu einer einzigen Domäne falten, mit einem zentralen fünfsträngigen β-Faltblatt, das von α-Helices umgeben ist. C und 5′ stellen den C-Terminus bzw. das 5′-Ende der ssDNA dar. c: Aktives Zentrum von TADAC-1.17 mit gebundenem ssDNA-d8Az-Übergangszustandsanalogon. Das katalytische Zinkion (graue Kugel) koordiniert H57, C87, C90 und das d8Az-Übergangszustandsanalogon (gelb). Die T82-Seitenkette (Cyan) befindet sich in der Nähe der katalytischen E59-Seitenkette (3,9 Å; gestrichelte Linie in Cyan) und spielt möglicherweise eine Rolle bei der Desaminierung, indem sie ein Proton an E59 abgibt bzw. von diesem aufnimmt. Der Rest A17 (Cyan) befindet sich in der α1-Helix an der Proteinoberfläche. Der Rest G48 (Cyan) befindet sich in der α2-Helix an der Substratbindungstasche. Die H-Brücken zwischen dem d8Az-Übergangszustandsanalogon und Proteinresten sind als graue gestrichelte Linien dargestellt. d: Die Seitenkette von E142, die sich in der α5-Helix befindet, geht Wasserstoffbrücken (graue gestrichelte Linie) mit der R153-Seitenkette ein, die sich in der α6-Helix befindet, und hilft, die C-terminale α6-Helix zu stabilisieren, um die F156-Seite zu positionieren Kette zur Wechselwirkung (cyanfarbene gestrichelte Linien) mit der Pyrimidinbase von dT(8).

a, Die Gesamtstruktur des funktionellen TADAC-1.14-Homodimers (Kette A in Dunkelgelb; Kette B in Hellgelb). Die Substitutionen (I49K, Y76I und G112H) relativ zu TadA*8.20 sind in magentafarbenen Kugeln dargestellt. Der Rest H2 ist fehlgeordnet und in der Struktur nicht sichtbar. Das Zinkion wird als graue Kugel dargestellt. Die gestrichelte Linie stellt die teilweise ungeordnete Schleife (A109 bis A114) zwischen β4 und β5 (R107 bis V130) dar. b, Die Gesamtstruktur des TADAC-1.14-Monomers. Die Überlagerung zwischen den Ketten A (dunkelgelb) und B (hellgelb) zeigt zwei unterschiedliche Konformationen für die Schleife zwischen β4 und β5 (R107 bis V130). c, aktives Zentrum von TADAC-1.14 mit Wasser (rote Kugel), gebunden an das Zinkion (graue Kugel). Die Reste H57, C87 und C90 koordinieren mit dem Zinkion. Das Wassermolekül (rote Kugel) geht H-Bindungen (graue gestrichelte Linien) zum katalytischen Rest E59 ein. Im ersten Schritt der TadA-Reaktion wird dieses Wasser dem Substrat zugesetzt, um eine Übergangszustandsspezies zu bilden (Extended Data Abb. 1a). d–f, Strukturvergleiche zwischen substratfreien TADAC-1.14- (dunkelgelb) und ssDNA-gebundenen TadA*8.20-Strukturen (dunkelgrün und gelb). Die TADAC-1.14-Schleife zwischen β4 und β5, die die Substitution G112H (magenta) enthält, hat eine andere Konformation als TadA*8.20 und kann die ssDNA-Bindung (gelb) beeinflussen, indem sie sterische Konflikte zwischen dem Rest A109 und der Base dT(8) verursacht. (1,8-Å), die an die Zielbasis d8Az(9) (d) angrenzt. Die Substitution Y76I (Magenta) beeinflusst die ssDNA-Bindung möglicherweise nicht, indem sie die Wechselwirkungen (schwarze gestrichelte Linien) mit der Base dG(12) (e) konserviert. Die Substitution I49K positioniert die K49-Seitenkette in der Nähe des dC(10)-Rückgrats (~4,5 Å; schwarze gestrichelte Linien) und kann zur Stabilisierung des Protein-DNA-Komplexes beitragen (e). Die Oberfläche von TADAC-1.14 (dunkel- und hellgelb) zeigt, dass die neuartige Konformation der Schleife zwischen β4 und β5 die Form des Hohlraums des aktiven Zentrums im Vergleich zu TadA*8.20 (dunkel- und hellgrün) verändert (f).

a, Gesamtstruktur des funktionellen Homodimers TADAC-1.19 (dunkel- und hellrosa). E27G- und I49N-Substitutionen relativ zu TadA*8.20 sind in orangefarbenen Kugeln dargestellt. Das Zinkion wird als graue Kugel dargestellt. b, Gesamtstruktur des TADAC-1.19-Monomers. C steht für den C-Terminus. c, aktives Zentrum von TADAC-1.19 mit Wasser (rote Kugel), gebunden an das Zinkion. H57, C87 und C90 koordinieren mit dem Zinkion. Das Wassermolekül geht H-Bindungen (gestrichelte Linien) mit dem katalytischen Rest E59 ein. d–h, Strukturvergleiche zwischen TADAC-1.19- und TadA*8.20-Strukturen. (d) Überlagerung zwischen substratfreien TADAC-1.19-Monomeren (rosa) und ssDNA-gebundenen TadA*8.20-Monomeren (grün, gelb), die eine hohe strukturelle Ähnlichkeit zeigen (RMSD von ~0,9 Å für alle Cα-Atome). Die wichtigsten strukturellen Unterschiede bestehen in der α1-Helix, der Schleife zwischen α1 und β1 sowie den C-terminalen α5- und α6-Helices. (e) TadA*8.20 weist eine E27-Seitenketten-H-Bindung (schwarze gestrichelte Linien) zu den Hauptketten von A48, I49 und G50 auf, und die E27G-Substitution beseitigt diese Wechselwirkungen. Um diese kritischen Kontakte zu kompensieren, platziert TADAC1.19 E25 an einer ähnlichen Position wie zuvor E27 in TadA*8.20, um die gleichen H-Brücken (orange gestrichelte Linien) mit A48, I49 und G50 zu bilden. Die E25-Verdrängung verkürzt die α1-Helix und die Schleife zwischen α1 und β1 (orange), die die E27G-Substitution enthält, wird verlängert und passt sich im Vergleich zu TadA*8.20 (d, f und g) einer anderen Konformation an. Dies führt zu einer teilweisen Entfaltung der α5-Helix, um einen sterischen Konflikt mit dieser Schleifenkonformation und einer vollständigen Entfaltung der α6-Helix (d und g) zu verhindern. Diese strukturellen Veränderungen verändern die Form des Hohlraums des aktiven Zentrums von TADAC-T1.19 (h) und beeinflussen die Substratbindung im aktiven Zentrum (Abb. 2b). R26 in der TADAC-T1.19-Schleife (orange) würde enge Kontakte (cyanfarbene gestrichelte Linien) mit dC(10) neben der Zielbase d8Az(9) und dG(11) von TadA*8.20-ssDNA herstellen ( G). I49N-Substitution positioniert die N49-Seitenkette weit vom ssDNA-Rückgrat entfernt (~9 Å von dG(11); cyanfarbene gestrichelte Linien) (f), was darauf hindeutet, dass ein Rest mit einer längeren positiv geladenen Seitenkette wie Lysin zusätzliche Kontakte mit herstellen würde ssDNA, wie in der TADAC-T1.14-Struktur beobachtet (Extended Data Abb. 3e).

a: In-vitro-24-Stunden-Endpunkt-Desaminierungstest zum Nachweis der relativen A-zu-I- (hAAG + APE1) und C-zu-U-Desaminierung (USERII) durch BE4, ABE8.20, CABE-Ts und CBE-Ts mit der gleichen Anleitung programmiert und auf das gleiche dsDNA-Substrat wirkend. Endonuklease V, Endo V; menschliche Alkyladenin-DNA-Glykosylase, hAAG; Apurinische/apyrimidinische Endonuklease 1, APE1. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert (grafisch dargestellt) von drei unabhängigen Replikaten dar. Die Daten wurden auf unbehandelte Proben normalisiert. Endo V erkennt sowohl A-zu-I- als auch C-zu-U-Desaminierung. b, Links: Einzelumsatzraten der A-zu-I- oder C-zu-U-Desaminierung desselben dsDNA-Substrats durch BE RNP. Rechts: Einzelumsatzraten von Nicking durch BE RNP im selben Experiment wie links gezeigt. Es werden Kapp-Geschwindigkeitskonstanten pseudo-erster Ordnung angegeben, die durch Anpassen an eine einzelne Exponentialfunktion erhalten wurden (Mittelwert ± Standardabweichung, n = 3 unabhängige Wiederholungen).

Quelldaten

a, Produktverteilung der Sequenzierungs-Reads, die wie bearbeitet für Kern-CBE-Ts und BE4 kartiert wurden, in denen das angegebene Ziel-Cytosin (rot hervorgehoben) mutiert ist. Die Werte wurden aus der Transfektion von HEK293T mit mRNA unter Sättigungsbedingungen bestimmt. Werte und Fehlerbalken spiegeln den Mittelwert und die SD bei n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten wider, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden. b, Farbkarte der maximalen C·G-zu-T·A-Umwandlungen außerhalb und 5′ des Protospacer-Zielfensters. Zielpositionen, bei denen für einen beliebigen Editor eine C-zu-T-Bearbeitung von >0,8 % festgestellt wurde, sind enthalten. Die Werte wurden aus der Transfektion von HEK293T mit mRNA-kodierenden Editoren oder Kontrollen unter Sättigungsbedingungen bestimmt, wobei n = 4 unabhängige biologische Replikate an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.

Quelldaten

Farbkarte der %-maximalen On-Target-Konvertierung von C·G zu T·A an genomischen Stellen und % der maximalen C·G-zu-T·A-Konvertierung an den entsprechenden Off-Target-Sites in HEK293T-Zellen, die mit mRNA-kodierendem Editor (oder Kontrolle) plus transfiziert wurden synthetische sgRNA unter Sättigungsbedingungen. Die Medianwerte wurden aus n = 3 unabhängigen biologischen Replikaten abgeleitet, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden.

Quelldaten

Ergänzende Abbildungen. 1–31, Ergänzungstabellen 1–5, Ergänzungssequenzen 1–31 und ergänzende Referenzen.

Statistische Quelldaten für ergänzende Abbildungen. 2–4, 6, 15, 17–21 und 24–29.

Gelbild-Quellendaten für ergänzende Abb. 22.

Gelbild-Quellendaten für ergänzende Abb. 23.

Statistische Quelldaten mit Excel-Registerkarten, die mit der Nummer der Abbildung oder Unterabbildung beschriftet sind.

Unbeschnittene Gele aller gezeigten gelbasierten Daten (einschließlich derjenigen für die ergänzenden Abbildungen 22 und 23, die stets mit den betreffenden Hauptabbildungen und erweiterten Abbildungen verknüpft sind).

ChemDraw-Strukturdatei mit erweiterten Daten Abb. 1

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lam, DK, Feliciano, PR, Arif, A. et al. Verbesserte Cytosin-Base-Editoren, die aus TadA-Varianten generiert wurden. Nat Biotechnol 41, 686–697 (2023). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

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Eingegangen: 16. August 2022

Angenommen: 09. November 2022

Veröffentlicht: 09. Januar 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-022-01611-9

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