SARS

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1299 (2023) Diesen Artikel zitieren

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mRNA-basierte Impfstoffe reduzieren das Auftreten und die Schwere von COVID-19 drastisch, sind jedoch mit seltenen impfstoffbedingten Nebenwirkungen verbunden. Diese Toxizitäten, gepaart mit Beobachtungen, dass eine SARS-CoV-2-Infektion mit der Entwicklung von Autoantikörpern verbunden ist, werfen die Frage auf, ob COVID-19-Impfstoffe auch die Entwicklung von Autoantikörpern fördern können, insbesondere bei Autoimmunpatienten. Hier verwendeten wir Rapid Extrazelluläres Antigen-Profiling, um selbst- und virusgesteuerte humorale Reaktionen nach der SARS-CoV-2-mRNA-Impfung bei 145 gesunden Personen, 38 Patienten mit Autoimmunerkrankungen und 8 Patienten mit mRNA-Impfstoff-assoziierter Myokarditis zu charakterisieren. Wir bestätigen, dass die meisten Personen nach der Impfung robuste virusspezifische Antikörperreaktionen erzeugten, dass die Qualität dieser Reaktion jedoch bei Autoimmunpatienten unter bestimmten Arten der Immunsuppression beeinträchtigt ist. Die Autoantikörperdynamik ist bei allen geimpften Patienten bemerkenswert stabil im Vergleich zu COVID-19-Patienten, die eine erhöhte Prävalenz neuer Autoantikörperreaktivitäten aufweisen. Patienten mit impfbedingter Myokarditis weisen im Vergleich zu Kontrollpersonen keine erhöhten Autoantikörperreaktivitäten auf. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass mRNA-Impfstoffe die SARS-CoV-2-Immunität von den während einer akuten COVID-19-Erkrankung beobachteten Autoantikörperreaktionen entkoppeln.

mRNA-basierte Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 haben eine bemerkenswerte Wirksamkeit bei der Vorbeugung symptomatischer Infektionen und der Schwere der COVID-19-Erkrankung gezeigt1,2, selbst im Zusammenhang mit hoch übertragbaren Varianten und Untervarianten3. Die durch diese Impfstoffe hervorgerufenen lebhaften Immunreaktionen gehen oft mit systemischen Entzündungsreaktionen einher, zu denen eine Erhöhung der zirkulierenden Plasmakonzentrationen von Zytokinen wie IL-15, IFNγ und CXCL104 gehört. Obwohl ihre Gesamtsicherheit im Vergleich zu anderen von der FDA zugelassenen Impfstoffen positiv ausfällt, wurden unerwünschte Ereignisse beobachtet, die von häufigen grippeähnlichen Symptomen bis hin zu seltenen Fällen von Myokarditis reichen5. Darüber hinaus wurden diese Impfstoffe mit Krankheitsschüben bei Patienten mit bereits bestehenden Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht6.

Zuvor haben wir und andere herausgefunden, dass eine akute SARS-CoV-2-Infektion mit einer Erhöhung der Autoantikörperreaktivitäten einhergeht, die auch mit der Schwere der Erkrankung korreliert7,8. Während einige dieser Reaktivitäten wahrscheinlich bereits existierten, waren andere neu oder zeigten einen zunehmenden Verlauf, der mit dem Ausbruch der Infektion zusammenfiel. Die Ätiologie dieser Antikörper muss noch vollständig geklärt werden, und potenzielle Mechanismen, die dem SARS-CoV2-Spike-Protein innewohnen – wie etwa die „molekulare Mimikry“ – erhöhen die Möglichkeit, dass Impfstoffe, die auf dasselbe Antigen abzielen, auch humorale Autoimmunität auslösen könnten. Darüber hinaus wurde noch nicht untersucht, ob sich die Autoantikörperreaktionen nach der Impfung bei zuvor mit COVID-19 infizierten Personen im Vergleich zu unbehandelten Personen unterscheiden.

In dieser Arbeit verwenden wir REAP, eine Exoproteom-weite Autoantikörper-Screening-Plattform, um zu zeigen, dass Autoantikörper während der Impfung im Vergleich zu akutem COVID-19, das durch eine erhöhte Prävalenz neuer und erhöhter Autoantikörper-Reaktivitäten gekennzeichnet ist, stabil sind.

Wir haben die Autoantikörper- und SARS-CoV-2-spezifischen Antikörperreaktionen von drei separaten Kohorten vor und nach der Impfung seriell überwacht (Abb. 1A). Die erste Kohorte9 bestand aus 33 Mitarbeitern des Gesundheitswesens (HCW) des Yale New Haven Hospital (YNHH), wobei etwa die Hälfte der Personen seropositiv für SARS-CoV-2 war (Ergänzungstabelle 1). Die zweite Kohorte bestand aus 38 Personen mit bereits bestehenden Autoimmunerkrankungen und 25 passenden gesunden Kontrollpersonen, die vom Benaroya Research Institute (BRI) rekrutiert wurden (Ergänzungstabelle 2). Die Kohorte der Autoimmunerkrankungen war vielfältig und umfasste 13 Patienten mit Multipler Sklerose (MS), 13 Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), jeweils 3 Patienten mit systemischem Lupus erythematodes (SLE), Typ-1-Diabetes (T1D) und Morbus Crohn (CD). . Die dritte Kohorte bestand aus 87 Freiwilligen aus der Dominikanischen Republik, die zuvor mindestens vier Wochen zuvor eine Zwei-Dosen-Kur des inaktivierten Ganzvirion-Impfstoffs CoronaVac erhalten hatten (Ergänzungstabelle 3). In dieser Kohorte wurde der mRNA-Impfstoff als „Booster“ verabreicht. Um die longitudinale Autoantikörperdynamik ohne Impfung zu beurteilen, schlossen wir auch eine Gruppe von 26 Personen ein, die über einen bestimmten Zeitraum überwacht wurden. Diese Längsschnitt-Kontrollkohorte bestand aus 14 gesunden Patienten und 12 Patienten mit Typ-1-Diabetes (Ergänzungstabelle 4).

Ein Yale HCW: 2 Dosen mRNA-Impfstoff; Plasma gesammelt bei: vor Dosis 1 – unmittelbar vor der Impfung; d7 – 7 Tage nach Dosis 1; vor Dosis 2 – unmittelbar vor Dosis 2, etwa 21–28 Tage nach Dosis 1; d7 pd2 – Tag 7 nach Dosis 2; d28 pd2 – Tag 28 nach Dosis 2. BRI: 2 Dosen mRNA-Impfstoff; Plasma, das vor Dosis 1 gesammelt wurde – vor der Impfung; d14 pd2 – Tag 14 nach Dosis 2; d90 pd2 – Tag 90 nach Dosis 2. CoronaVac Booster: 1 Dosis mRNA-Impfstoff >4 Wochen nach 2 Dosen CoronaVac. Plasma, das vor der Auffrischimpfung gesammelt wurde – vor der Impfung; d28 – Tag 28 nach der Auffrischimpfung. Längsschnitt-Kontrollkohorte: Ungeimpfte Teilnehmer; Plasma gesammelt am d0 – Tag 0; d7 – Tag 7; d30 – Tag 30; d60 – Tag 60; d90 – Tag 90; d120 – Tag 120) B–D CoV-2-RBD REAP-Score für jeden Patienten vor und nach der Impfung in den Yale HCW-, CoronaVac Booster- und BRI-Kohorten. Jedes Punktpaar repräsentiert ein einzelnes Individuum. E, F CoV-2-RBD REAP-Score (E) und SARS-CoV-2-Neutralisierungskapazität (F) zum letzten Zeitpunkt. Die Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA (p = 2,45E − 7 (E), p = 2,81E − 6 (F) bewertet, wobei Post-hoc-Tests unter Verwendung des Dunnett-Tests durchgeführt wurden, um den Mittelwert jeder Spalte mit der gesunden Kontrolle (CD20 vs . Kontrolle: p = 5,1E − 8 (E), CTLA4 vs. Kontrolle: p = 0,0145 (E); CD20 vs. Kontrolle: p = 1,35E − 7 (F), TNF/DM vs. Kontrolle: p = 0,034 (F). Das Boxplot-Feld stellt das 25. bis 75. Perzentil der Daten dar, die mittlere Linie stellt den Median dar und die oberen/unteren Whisker stellen den Maximal-/Mindestwert innerhalb des 1,5 × 75./25. Interquartilbereichs dar. N = 25 gesunde Personen, 38 Autoimmunpersonen. G Neutralisationskapazität versus S1-RBD-ELISA-Reaktivität. Die Regression zeigt die Beziehung zwischen log(PRNT50) und S1-RBD-ELISA für gesunde Teilnehmer, 95 %-KI schattiert, Regressionslinie zentriert. Jeder Punkt stellt ein einzelnes Individuum dar. N = 25 gesund Personen, 38 Autoimmunpersonen. HS-Gesamt-ELISA-Reaktivität (ng/ml) vs. S1-RBD-ELISA-Reaktivität (ng/ml), stratifiziert nach Autoimmunerkrankungsstatus und Medikamentenkategorie. ****p < 0,0001, ***p < 0,001 **p < 0,01 und *p < 0,05.

Um Antikörperreaktionen gegen extrazelluläre Antigene und die SARS-CoV-2-S1-Rezeptor-Bindungsdomäne (SARS-CoV-2-RBD) zu messen, verwendeten wir schnelles extrazelluläres Antikörper-Profiling (REAP), eine Hefe-Display-Bibliotheksplattform, die eine gleichzeitige Bewertung von ermöglicht Antikörperreaktivität gegen 6183 menschliche extrazelluläre Proteine, Peptidepitope und häufige Coronavirus-Spike-RBD-Proteine, einschließlich SARS-CoV-2 RBD7,10. Durch REAP nachgewiesene Antikörperreaktivitäten werden durch einen REAP-Score (siehe Methoden) quantifiziert, der stark mit den Antikörpertitern korreliert.

Wie erwartet reagierten alle Personen in der HCW-Kohorte nach der Impfung durch REAP auf SARS-CoV-2-RBD (Abb. 1B), wobei alle seronegativen Personen eine neue Reaktion erzeugten. Die SARS-CoV-2-RBD-REAP-Scores für seropositive Personen blieben nach der Impfung entweder stabil hoch oder stiegen an. Innerhalb der CoronaVac-Booster-Kohorte waren die Reaktionen unterschiedlicher, stiegen jedoch weitgehend an oder blieben stabil (Abb. 1C). Innerhalb der BRI-Kohorte reagierten alle gesunden Personen und die meisten Autoimmunpatienten auf die Impfung und zeigten zum letzten Zeitpunkt eine Reaktivität gegenüber SARS-CoV-2-RBD (Abb. 1D). Patienten unter Anti-CD20-B-Zell-Depletionstherapie, von denen die meisten mit Multipler Sklerose (MS) diagnostiziert wurden, zeigten nach der Impfung deutlich geringere SARS-CoV-2-RBD-Antikörperreaktionen (p < 0,0001) (Abb. 1E, S1A). Innerhalb dieser Behandlungsgruppe war die Wahrscheinlichkeit einer humoralen Reaktion bei MS-Patienten, die Ocrelizumab einnahmen, geringer als bei Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen, die Rituximab einnahmen (Abb. S1B). Während die meisten MS-Patienten keine SARS-CoV-2-RBD-Antikörperreaktion erzeugten, erzeugten zwei Patienten – einer ohne Therapie und einer unter Dimethylfumarat (DMF) – laut REAP normale SARS-CoV-2-RBD-Antikörperreaktionen (Abb . S1C).

Um die SARS-CoV-2-Immunantwort bei autoimmunen und gesunden Personen in der BRI-Kohorte weiter zu charakterisieren, führten wir einen ELISA für das S1-RBD und das Full-Spike-Protein (S total) sowie Neutralisationstests gegen den SARS-CoV-2-Stamm USA durch -WA1/2020. Wir fanden eine starke Korrelation (R = 0,9, p < 2,2e−16) zwischen dem SARS-CoV-2-RBD-REAP-Score und dem S1-RBD-ELISA-Titer (Abb. S1D), was die oben aus REAP generierten Schlussfolgerungen stützt. Interessanterweise zeigten die meisten Autoimmunpatienten zwar eine normale Reaktion auf die Impfung, gemessen anhand des Anti-S1-RBD-Titers oder des REAP-Scores, diese Patienten zeigten jedoch auch eine verminderte Neutralisationsfähigkeit (PRNT50) (Abb. 1F). Dieser Trend war besonders ausgeprägt bei Patienten mit Anti-CD20-B-Zell-Depletion (p < 0,0001). Abbildung 1G zeigt den S1-RBD-ELISA-Titer und PRNT50 für alle Patienten, mit einer linearen Regression für die Beziehung zwischen diesen beiden Parametern nur bei gesunden Personen. Eine Untergruppe von Patienten, die sich im unteren rechten Bereich der Regressionslinie befanden, beispielsweise mehrere Patienten, die Anti-TNFα und/oder eine Therapie mit krankheitsmodifizierenden Antirheumatika (DMARD) erhielten, zeigte hohe Anti-S1-RBD-Titer mit schlechter Neutralisierungsfähigkeit. Der darauf hinweisende Anti-RBD-Titer spiegelt möglicherweise nicht vollständig die Qualität des humoralen Immunschutzes bei Patienten unter immunsuppressiver Therapie wider. Schließlich zeigten einige Patienten, die keine S1-RBD-spezifische Reaktion erzeugten, im ELISA immer noch eine Reaktivität gegenüber S total, was eine eingeschränkte humorale Reaktion weiter unterstützt, die zum Targeting von Nicht-RBD-Epitopen führen kann (Abb. 1H).

Als nächstes untersuchten wir mit REAP Veränderungen der Autoreaktivität gegenüber extrazellulären Antigenen während der Impfung. Während bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen eine größere Bandbreite an bereits vor der Impfung bestehenden Autoantikörper-Reaktivitäten auftrat, unterschied sich die mittlere Anzahl der Reaktivitäten weder zwischen Kontrollpersonen oder Personen mit Autoimmunerkrankungen noch zwischen den verschiedenen Autoimmundiagnosen signifikant (Abb. S2A, S2B). In ähnlicher Weise gab es in der Yale HCW-Kohorte und der CoronaVac-Booster-Kohorte keinen Unterschied in der Anzahl bereits bestehender Reaktivitäten zwischen denen, die zuvor mit SARS-CoV2 infiziert waren, und denen, die naiv waren (Abb. S2C, S2D). Insgesamt stellten wir fest, dass die überwiegende Mehrheit der Autoantikörperreaktivitäten sowohl in der Impf- als auch in der Längsschnitt-Kontrollkohorte über die Zeit bemerkenswert stabil war. Beispielsweise zeigt Abb. 2A die Autoantikörper- und SARS-CoV-2-RBD-Antikörper-Trajektorie eines RA-Patienten (unter Anti-TNFα-Therapie). Bei dieser Person blieben die durch REAP nachgewiesenen Autoantikörper während der Impfung im Score stabil, mit Ausnahme von Anti-GPC6, der mit der Zeit abnahm. Um alle Personen in jeder Kohorte überlagert anzuzeigen, haben wir alle REAP-Antigen-Scores auf einen Startscore von 0 normalisiert, indem wir ihren Score zum ersten Zeitpunkt von ihrem Score zu späteren Zeitpunkten subtrahiert haben. Abbildung 2B zeigt die normalisierten REAP-Score-Trajektorien für Autoantikörper bei jedem Individuum aus der BRI-Kohorte. Insgesamt lagen die Veränderungen des Autoantikörper-REAP-Scores während der Impfung bei etwa Null (99,9 %-KI: Autoimmunerkrankung: −0,10 bis 0,29; Kontrolle: −0,043 bis 0,56) und unterschieden sich nicht zwischen Patienten mit Autoimmunerkrankung und gesunden Kontrollpersonen.

A Antikörper eines RA-Patienten während der mRNA-Impfung (CoV-2-RBD – rot, Autoantikörper – grau, therapeutischer a-TNF-Ab – blau). B-Liniendiagramm: Autoantikörper- (blau) und CoV-2-RBD- (rot) REAP-Score-Trajektorien der BRI-Kohorte während der Impfung (nur Exo201-Antigene). Jede Linie stellt eine Reaktivität dar, normalisiert auf einen Basiswert von 0. Dichtediagramm: REAP-Score-Deltas für Reaktivitäten in der BRI-Kohorte. Mögliche Arzneimittelantikörper (a-TNF, a-IL6R) wurden ausgeschlossen. C Durchschnittliche REAP-Score-Änderung für Autoantikörperreaktivitäten pro Person vom ersten bis zum letzten Zeitpunkt in der BRI- und Längskontrollkohorte (alle Antigene). p = 0,075, durch einfache ANOVA. Fehlerbalken zeigen ein 99 %-KI. Mögliche Arzneimittelantikörper (a-TNF, a-IL6R) wurden ausgeschlossen. Jeder Punkt repräsentiert eine Person. Personen ohne Reaktivität wurden ausgeschlossen. N = Impfstoff/Autoimmun: 37; geimpft/gesund: 24; Kontrolle/Autoimmun: 8; Kontrolle/gesund:11. D-Liniendiagramm: Autoantikörper- (blau) und CoV-2-RBD- (rot) REAP-Score-Trajektorien von Patienten mit akutem COVID-19 (nur Exo201-Antigene). Jede Linie stellt eine Reaktivität dar, normalisiert auf einen Startwert von 0. DFSO = Tage ab Symptombeginn. Dichtediagramm: REAP-Score-Deltas für Reaktivitäten in der COVID-19-Kohorte. Mögliche Arzneimittelantikörper (a-TNF, a-IL6R) wurden ausgeschlossen. E Anteil der Patienten mit n erhöhten Reaktivitäten (nur Exo201-Antigene). p = 1,3E − 7, nach Kruskal-Wallis, Dunns Post-hoc-Test (Korrektur nach Holms Methode): schwer vs. Impfung, p = 6,1E − 7; schwer vs. Kontrolle, p = 1,1E − 3; mäßig vs. Impfung, p = 6,1E − 7; mäßig vs. Kontrolle, p = 4,0E − 3. Erhöhte Reaktivität = Anstieg des REAP-Scores um >3 zu jedem Zeitpunkt. Mögliche Arzneimittelantikörper (a-TNF, a-IL6R) wurden ausgeschlossen. N: schweres COVID19: 23; mittelschweres COVID19: 36; Impfstoff: 183; Kontrolle: 26. F-Reaktivitäten bei Patienten oder Kontrollpersonen mit impfassoziierter Myokarditis. Antigene gruppiert nach Expressionsdaten des Human Protein Atlas. G Autoantikörper-Reaktivitäten pro Person in der mRNA-Impfstoff-assoziierten Myokarditis-Kohorte im Vergleich zur Kontrolle. p = 0,45, ungepaarter zweiseitiger t-Test. Das Boxplot-Feld stellt das 25. bis 75. Perzentil der Daten dar, die mittlere Linie stellt den Median dar und die oberen/unteren Whisker stellen den Maximal-/Mindestwert innerhalb des 1,5× 75./25. Interquartilbereichs dar. N = Kontrolle: 8; Myokarditis: 8. H IL-1RA-Autoantikörper-ELISA des Myokarditis-Patientenserums. ****p < 0,0001, ***p < 0,001 **p < 0,01 und *p < 0,05.

Auch die Autoantikörperdynamik von Personen ohne Impfung war im Laufe der Zeit weitgehend stabil, mit einem ähnlichen Variationsgrad im Vergleich zur Impfkohorte (99,9 % KI: Autoimmun: −0,62 bis 0,28; Gesund: −0,37 bis 0,38) (Abb. S3A). Auch die durchschnittliche Autoantikörperveränderung pro Person (Abb. 2C) unterschied sich nicht zwischen gesunden oder autoimmungeimpften Patienten, noch gab es einen Unterschied zwischen geimpften und ungeimpften Patienten beider Gruppen (p = 0,075). Die Ähnlichkeit zwischen Autoimmunpatienten und gesunden Patienten blieb auch nach dem getrennten Vergleich der Autoimmunpatienten mit und ohne Immunsuppression bestehen, was darauf hindeutet, dass das Fehlen neuer Autoantikörper in dieser Gruppe nicht auf Immunsuppression zurückzuführen ist (Abb. S3B). Darüber hinaus hatten vier RA-Patienten während oder rund um ihre Impfung auch Glukokortikoide erhalten. Wir haben keine Unterschiede in der durchschnittlichen Autoantikörperveränderung pro Person zwischen RA-Patienten mit und ohne Glukokortikoidbehandlung festgestellt (Abb. S3C). Ähnliche Trends wurden in der CoronaVac-Booster-Kohorte (99,9 % KI: −0,71 bis 0,16) (Abb. S3D) und der Yale HCW-Kohorte (Abb. S3E) beobachtet; Allerdings waren die gesamten Autoantikörperveränderungen für beide HCW-Gruppen leicht negativ (99,9 % KI: seronegativ: –0,50 bis –0,22; seropositiv: –0,36 bis –0,02). Die durchschnittliche Autoantikörperveränderung pro Person unterschied sich nicht zwischen seronegativem oder seropositivem medizinischem Personal oder ungeimpften Kontrollpersonen (p = 0,69) (Abb. S3F).

Als nächstes fragten wir, ob sich die während der SARS-CoV-2-Impfung beobachteten Autoantikörperverläufe von denen unterschieden, die während einer akuten COVID-19-Erkrankung beobachtet wurden. Um diese Frage zu beantworten, analysierten wir REAP-Daten einer Kohorte von 36 mittelschweren und 23 schweren COVID-19-Patienten, die zwischen März und Mai 202011 am YNHH hospitalisiert wurden (Ergänzungstabelle 5). Optisch unterscheiden sich die Autoantikörperverläufe während der Impfung deutlich von denen, die bei Patienten mit mittelschwerer oder schwerer akuter COVID-19-Erkrankung beobachtet werden, die im Verlauf der Infektion zahlreiche erhöhte und neue Autoantikörperreaktivitäten aufweisen (Abb. 2D). Fast die Hälfte der Patienten mit schwerer und ein Drittel der mittelschweren COVID-19-Patienten hatten mindestens eine erhöhte oder neue Autoantikörperreaktivität, bei einem erheblichen Teil sogar mehrere. (Abb. 2E bzw. S4A). Im Gegensatz dazu war dieses Phänomen während der Impfung äußerst selten; Von insgesamt 1034 Autoantikörper-Reaktivitäten, die in den Impfstoffkohorten festgestellt wurden, traten nur 15 (1,45 %) in den Monaten nach der Impfung neu auf (Abb. S4B). Bei COVID-19-Patienten haben wir 24 neue Autoantikörperreaktivitäten von insgesamt 463 Autoantikörpern (5,18 %) festgestellt (Abb. S4C). Bei dieser Kennzahl handelt es sich wahrscheinlich um eine Unterschätzung des Anstiegs der Autoantikörper bei COVID-19, da in der akuten COVID-19-Kohorte eine kleinere Bibliothek von Antigenen getestet wurde (2777 Antigene – Exo201-Bibliothek) im Vergleich zu der größeren, aktualisierten Bibliothek, die für die Impfstoffkohorte verwendet wurde (6183 Antigene) und das kürzere Zeitfenster, in dem diese Personen überwacht wurden. Ebenso schließt das Fehlen einer Vorinfektions-Basislinie für diese Patienten den Nachweis neuer Autoantikörper-Reaktivitäten aus, die nach der Infektion, aber vor der Entnahme der ersten Probe für jeden Patienten, auftraten. Während die Autoantikörperreaktivitäten in der Impfstoffkohorte insgesamt stabil waren, verzeichneten wir einen Anstieg des REAP-Scores für TNFα bei einem Patienten mit rheumatoider Arthritis, der mit einer Adalimumab-Therapie (einem monoklonalen Anti-TNFα-Antikörper) im Zeitraum zwischen der Prä- und Postimpfung begonnen hatte. Impfproben (Abb. S4D). Dieser Befund zeigt die Empfindlichkeit von REAP beim Nachweis neuer Autoantikörper im Laufe der Zeit.

Um zeitliche Unterschiede zwischen der akuten COVID-19-Kohorte, die durchschnittlich 10,3 (erster Zeitpunkt) bis 18,1 (letzter Zeitpunkt) Tage nach Symptombeginn betrug, und den Impfkohorten zu berücksichtigen, die obligatorisch mindestens 28 Tage lang sind, sich aber nach oben erstrecken In einigen Fällen führten wir auch eine separate Analyse zu Zeitpunkten durch, die 28 Tage oder weniger nach Dosis 1 oder dem Einsetzen der Symptome lagen. In dieser zeitlich abgestimmten Analyse bleiben die obigen Schlussfolgerungen unverändert, wobei akute COVID-19-Patienten wiederum deutlich mehr erhöhte (Abb. S5A) und neue (Abb. S5B) Autoantikörperreaktivitäten sowie ein deutlich erhöhtes Gesamt-Autoantikörper-Delta aufwiesen (Abb. S5C). .

Um die Faktoren besser zu verstehen, die mit dem Ausmaß der erhöhten Autoantikörper-Reaktivitäten bei COVID-19-Patienten im Vergleich zu geimpften Patienten verbunden sind, haben wir eine multiple lineare Regression durchgeführt, um dieses Phänomen zu modellieren. Im Modell für die COVID-19-Kohorte (angepasstes R2: 0,1785, p-Wert: 0,015) waren zunehmendes Alter, weibliches Geschlecht und ein klinischer Schweregrad von 6 signifikant mit einem erhöhten Ausmaß erhöhter Autoantikörperreaktivitäten verbunden (p = 0,0482, p = 0,0185 bzw. p = 0,0143) (Abb. S6A–D). Darüber hinaus verbesserte die Hinzufügung des klinischen Scores im Vergleich zu einem Basismodell, das nur individuelle Unterschiede in Alter und Geschlecht berücksichtigte, die Anpassungsgüte des Gesamtmodells deutlich (p = 0,01328). Umgekehrt waren im Benaroya-Impfstoff-Kohortenmodell (angepasstes R2: 0,0049, p-Wert: 0,39) weder Geschlecht, Alter, Überwachungszeitraum, Impfstofftyp noch Krankheitsstatus (gesund vs. autoimmun) signifikant mit dem Ausmaß des Anstiegs verbunden Autoantikörperreaktivitäten (Abb. S6E). Insgesamt zeigt der Vergleich der Autoantikörperverläufe zwischen der COVID-19- und der SARS-CoV-2-Impfung, dass COVID-19-Patienten ein charakteristisches Muster neuer und erhöhter Autoantikörper aufweisen, das mit dem höchsten klinischen Schweregrad, Alter und weiblichem Geschlecht korreliert. Umgekehrt waren die Veränderungen der Autoantikörper während der Impfung ähnlich wie bei ungeimpften Kontrollpersonen, ohne dass ein Muster in Form neuer oder erhöhter Reaktivitäten erkennbar war, selbst bei Personen, die zu Autoimmunerkrankungen neigen.

Schließlich versuchten wir, extrazelluläre Autoantikörper bei Patienten mit mRNA-Impfstoff-assoziierter Myokarditis zu profilieren, einem seltenen, aber potenziell schwerwiegenden unerwünschten Ereignis, das im Zusammenhang mit der SARS-CoV-2-mRNA-Impfung berichtet wurde5. Um dies zu untersuchen, führten wir REAP an Plasmaproben von 8 Patienten durch, die sich zwischen Mai und Oktober 2021 bei YNHH vorstellten, mit einer durch MRT bestätigten Myokarditis, die 1–3 Tage (Mittelwert: 2,75) nach der zweiten mRNA-Impfstoffdosis begann (Ergänzungstabelle 6). Die Myokarditis-Kohorte erhielt ausschließlich den Pfizer-Impfstoff, da dies zum Zeitpunkt unserer Studie der einzige zugelassene mRNA-Impfstoff war. Abbildung 2F zeigt eine Heatmap der REAP-Autoantikörper-Reaktivitätswerte für Myokarditis-Patienten sowie alters- und geschlechtsangepasste Kontrollpersonen. Patienten mit Myokarditis zeigten im Vergleich zu Kontrollpersonen keine erhöhte Anzahl an Autoantikörpern (Abb. 2G) und auch keine Autoantikörper gegen kardiale oder endothelial angereicherte Antigene oder Antigene, die zuvor mit entzündlichen Herzerkrankungen in Verbindung gebracht wurden, wie z. B. Anti-B-Adrenorezeptor-Antikörper12. Eine Studie berichtete kürzlich über eine hohe Häufigkeit funktioneller Anti-IL1RA-Autoantikörper bei Patienten mit impfbedingter Myokarditis13. Interessanterweise konnten wir in unserer Kohorte mittels REAP oder IL-1RA ELISA keine IL-1RA-Autoantikörper nachweisen (Abb. 2H, S7A). Diese Diskrepanz kann auf Unterschiede in der Kohortendemografie oder auf eine hohe Häufigkeit von Anti-Arzneimittel-Antikörpern gegen biologische IL-1RA-Wirkstoffe im anderen Bericht zurückzuführen sein, in dem nicht erwähnt wurde, ob Patienten diese Therapie erhalten hatten.

Unsere hier erzielten Ergebnisse stimmen mit mehreren neueren Berichten überein, die die Aktivierung des angeborenen Immunsystems und eine erhöhte Häufigkeit aktivierter zytotoxischer CD8-T-Zellen und NK-Zellen bei impfassoziierter Myokarditis im Gegensatz zur B-Zell-Aktivierung oder Plasmazellinfiltration hervorheben14,15,16. Aufgrund der Einschränkungen der Hefe-Display-Technologie enthält die REAP-Bibliothek jedoch keine intrazellulären Proteine. Daher schließen unsere Ergebnisse nicht die Möglichkeit aus, dass intrazellulär gezielte Autoantikörper vorhanden sein könnten, beispielsweise Anti-Myosin, über das auch bereits bei anderen Arten von Myokarditis berichtet wurde. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse jedoch, dass es unwahrscheinlich ist, dass Veränderungen der für extrazelluläre Antigene spezifischen Autoantikörper einer mRNA-Impfstoff-assoziierten Myokarditis zugrunde liegen.

Während wir eine kleine Anzahl neuer oder erhöhter Autoantikörper-Reaktivitäten nach der Impfung festgestellt haben, deutet das Vorhandensein dieses Phänomens in der ungeimpften Kontrollgruppe darauf hin, dass dies eher auf physiologische Schwankungen der Autoantikörper-Konzentrationen als auf eine Auswirkung der Impfung zurückzuführen sein könnte. Darüber hinaus sprechen mehrere Faktoren gegen kausal verknüpfte oder stereotype Autoantikörperreaktionen bei geimpften Patienten. Dazu gehört das Fehlen jeglicher Unterschiede zwischen Autoantikörperveränderungen bei Autoimmunpatienten und gesunden Patienten; die Tatsache, dass sich die Nettoveränderungen der Autoantikörper um Null drehten (d. h. ungefähr die gleiche Anzahl an Autoantikörperreaktionen nahm nach der Impfung zu wie die Zahl der abgenommenen); und das Fehlen gemeinsamer Autoantikörper bei Patienten mit oder ohne mRNA-Impfstoff-assoziierter Myokarditis.

Darüber hinaus steht das nach der Impfung beobachtete Fehlen von Autoantikörperveränderungen in deutlichem Kontrast zur akuten COVID-19-Erkrankung, die mit erhöhten und neuen Autoantikörperreaktivitäten im Verlauf der Krankheit einhergeht. Dieser Befund passt zu einem sich abzeichnenden Bild einer pathologischen humoralen Immunschwäche bei COVID-19, die zu überschwänglichen B-Zell-Reaktionen führt, die an systemischen Lupus erythematodes (SLE) erinnern17 und zur Produktion von Autoantikörpern, die thrombotische Syndrome verursachen18, Typ-1-IFN-Programme dämpfen19,20 und neutralisieren die Zytokin- und Chemokinsignale7. Während die Mechanismen hinter der Entstehung dieser Autoantikörper unklar sind, ist es plausibel, dass eine pathologische Entzündung eine Rolle spielt, die beispielsweise zu Gewebeschäden und der Freilegung von sequestrierten Antigenen, einer unbeteiligten Aktivierung autoreaktiver B-Zellklone durch ein hyperinflammatorisches Zytokinmilieu und/oder führt übertriebene Proliferation polyspezifischer B-Zell-Klone. Der Unterschied in der Autoantikörperdynamik zwischen akutem COVID-19 und Impfung und die Korrelation des höchsten klinischen Schweregrads von COVID-19 mit dem Ausmaß erhöhter Reaktivitäten stützen die Annahme, dass die Autoantikörperinduktion eher mit der Immunpathologie von COVID-19 als mit Attributen zusammenhängt des SARS-CoV-2-Spike-Antigens, was zu Phänomenen wie der „molekularen Mimikry“ führt.

Unter Berufung auf die Zunahme von Durchbruchinfektionen empfiehlt das CDC weiterhin eine dritte und vierte mRNA-Impfstoffdosis21 für immungeschwächte Personen, einschließlich Patienten mit Autoimmunerkrankungen, die immunsuppressive Therapien erhalten. Dieses Thema steht derzeit im Mittelpunkt mehrerer laufender klinischer Studien. Während die Stichprobengröße unserer Studie für bestimmte Diagnose- und Medikamentengruppen begrenzt ist, zeigt sie doch eine Einschränkung auf, wenn man sich auf Anti-SARS-CoV-2-Titer als Korrelat der schützenden Immunität bei autoimmunen/immunsupprimierten Patienten verlässt. Bemerkenswerterweise stellten wir fest, dass die meisten Autoimmunpatienten zwar nach der Impfung RBD-spezifische Antikörper erzeugen, ihre Antikörper jedoch häufig nicht neutralisierend waren, im Gegensatz zu gesunden Personen, bei denen die Korrelation zwischen Antikörpertitern und neutralisierender Fähigkeit stark war. Dies deutet darauf hin, dass die bei diesen Personen erzeugte Anti-SARS-CoV-2-Antikörperreaktion möglicherweise eingeschränkt und weniger wirksam ist, beispielsweise aufgrund der gezielten Bekämpfung unkritischer Epitope oder des Fehlens schützender Anti-N-terminal-Domänen (NTD)-Antikörper22 . Dies zeigte sich besonders deutlich bei Personen, die B-Zell-Depletionstherapien erhielten, bei denen die Wahrscheinlichkeit am geringsten war, dass sie eine neutralisierende Antikörperreaktion erzeugten, wie aus einem anderen aktuellen Bericht hervorgeht23. Interessanterweise bildeten einige dieser Patienten dennoch nicht neutralisierende Antikörper gegen das vollständige S-Protein, was wahrscheinlich auf eine ineffiziente humorale Reaktion zurückzuführen ist, die durch die B-Zell-Depletion eingeschränkt wird. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass unsere Studie nicht die T-Zell-Reaktionen auf die SARS-CoV-2-Impfung gemessen hat, die nachweislich einen wichtigen Beitrag zur SARS-CoV-2-spezifischen Immunität leisten24,25. Dies ist besonders relevant für Personen unter Immunsuppression, bei denen möglicherweise keine Korrelation zwischen humoralem und zellulärem Immunschutz nach der Impfung zu erwarten ist, wie dies bei MS-Patienten unter Ocrelizumab23 beobachtet wurde. Daher können wir in unserer Studie nicht definitiv auf den vollen Grad des Immunschutzes für die einzelnen Personen schließen.

Zusammenfassend stellten wir fest, dass die mRNA-Impfung im krassen Gegensatz zur SARS-CoV-2-Infektion nicht mit der Entwicklung neuer Autoantikörperreaktionen auf das extrazelluläre Proteom verbunden war. Darüber hinaus gab es trotz Unterschieden in der Qualität der SARS-CoV-2-Reaktion, die bei Autoimmunpatienten und gesunden Patienten nach der mRNA-Impfung hervorgerufen wurde, keinen Unterschied in der Dynamik von Autoantikörpern gegen extrazelluläre Selbstantigene, selbst bei Patienten mit bereits bestehender Autoimmunerkrankung oder Impfung. damit verbundene Myokarditis. Diese Arbeit stärkt somit das neue Sicherheitsprofil von mRNA-Impfstoffen und unterstreicht ihre Fähigkeit, die SARS-CoV-2-Immunität von den möglichen langfristigen Autoimmunfolgen von COVID-19 zu entkoppeln.

Für die BRI-Kohorte wurden Probanden mit und ohne Autoimmunität unter der Protokollnummer IRB08108 eingeschrieben, die vom BRI Institutional Review Board genehmigt wurde. Alle Probanden gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme an dieser Studie gemäß Studienprotokoll ab. Für die Yale HCW-Kohorte wurden die Probanden unter der Protokollnummer 2000028924 eingeschrieben, die vom Institutional Review Board des Yale Human Research Protection Program genehmigt wurde. Die Einverständniserklärung aller eingeschriebenen Teilnehmer wurde eingeholt. Die CoronaVac Booster-Studie wurde vom Nationalen Bioethikkomitee der Dominikanischen Republik (CONABIOS) genehmigt. Die Teilnehmer erhielten zwei Dosen des inaktivierten Ganzvirion-Impfstoffs CoronaVac, gefolgt von einer BNT162b2-Auffrischungsdosis mindestens vier Wochen nach der zweiten Dosis CoronaVac. Alle DR-Teilnehmer stimmten der Teilnahme an dieser Beobachtungsstudie zu. Für die Myokarditis-Kohorte wurden Probanden unter den Protokollnummern 2000028924 und 1605017838 eingeschrieben, die vom Institutional Review Board des Yale Human Research Protection Program genehmigt wurden. Die Einverständniserklärung aller eingeschriebenen Teilnehmer wurde eingeholt. Alle hier beschriebenen Forschungsarbeiten an menschlichen Probanden wurden in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki durchgeführt.

Beim Studiendesign wurde das Geschlecht berücksichtigt, mit dem Ziel, möglichst etwa den gleichen Anteil männlicher und weiblicher Teilnehmer zu rekrutieren. Das Geschlecht wurde anhand der Selbstauskunft der Teilnehmer bestimmt.

Patienten in der akuten COVID-19-Kohorte wurden nach Schweregrad der Erkrankung stratifiziert, basierend auf dem Sauerstoffgehalt und dem Bedarf auf der Intensivstation, wie zuvor beschrieben11. Ein mäßiger Krankheitsstatus (klinischer Score 1, 2 oder 3) wurde definiert als: (1) SARS-CoV-2-Infektion, die einen Krankenhausaufenthalt ohne zusätzlichen Sauerstoff erfordert, (2) Infektion, die nicht-invasiven zusätzlichen Sauerstoff erfordert (<3 l/min, ausreichend). um >92 % SpO2 aufrechtzuerhalten) oder (3) eine Infektion, die nicht-invasiven zusätzlichen Sauerstoff erforderte (>3 l/min, ausreichend, um >92 % SpO2 aufrechtzuerhalten, oder >2 l zusätzlichen Sauerstoff erforderte, um SpO2 > 92 % aufrechtzuerhalten und hatte ein hochempfindliches C-reaktives Protein (CRP) > 70 und erhielten Tocilizumab). Ein schwerer Krankheitsstatus (klinischer Score 4 oder 5) wurde als Erfüllung der Kriterien für Score 3 definiert und erforderte gleichzeitig die Aufnahme auf die YNHH-Intensivstation (ICU) und >6 l zusätzlichen Sauerstoff, um SpO2 > 92 % aufrechtzuerhalten (4), oder erforderte eine Infektion invasive mechanische Beatmung und/oder extrakorporale Membranoxygenierung (ECMO) zusätzlich zur Verabreichung von Glukokortikoiden/Vasopressoren (5). Für verstorbene Patienten wurde der klinische Score 6 vergeben; In dieser Studie wird es jedoch zur Gruppe der schweren Erkrankungen gezählt.

Die anfängliche Hefebibliothek (Exo201) wurde wie zuvor beschrieben erstellt7,10. In Exo201 wurde nur die größte extrazelluläre Domäne von Multi-Pass-Membranproteinen in die Bibliothek aufgenommen. In dieser Studie haben wir die Bibliothek weiter erweitert, indem wir alle extrazellulären Domänen von Multi-Pass-Membranproteinen mit mehr als 15 Aminosäuren ergänzt haben. Darüber hinaus haben wir größere Antigene identifiziert und hinzugefügt, die in Exo201 beispielsweise aufgrund eines PCR-Fehlers versagten. Ein Inventar neu hinzugefügter Antigene ist im Ergänzungsdatensatz 1 zusammengestellt. DNA für neue Antigene wurde entweder als Genfragment (für Antigene über 300 Nukleotide) oder als Oligo-Pool von TWIST Bioscience synthetisiert und enthält eine 5'-Sequenz (CTGTTATTGCTAGCGTTTTAGCA) und 3 ′-Sequenz (GCGGCCGCTTCTGGTGGC) für die PCR-Amplifikation. Der Oligo-Pool wurde PCR-amplifiziert und mit Barcode-Fragmenten in Hefe transformiert, gefolgt von der Identifizierung der Barcode-Antigen-Paarung wie zuvor beschrieben7,10. Diese neue Hefebibliothek wurde dann mit der ursprünglichen Bibliothek (Exo201) im Verhältnis 1:1 gepoolt, um die neue Version der Bibliothek (Exo204) zu erzeugen.

Die Antikörperreinigung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt7,10. Kurz gesagt, Triton x-100 und RNase wurden dem Patientenplasma in einer Endkonzentration von 0,5 % bzw. 0,5 mg/ml zugesetzt und 30 Minuten lang inkubiert, um umhüllte RNA-Viren zu inaktivieren. 20 µL Protein-G-Magnetharz (lytische Lösungen) wurden gewaschen und in PBS resuspendiert und zu 50 µL inaktiviertem Plasma gegeben. Das Serum-Harz-Gemisch wurde drei Stunden lang bei 4 °C unter Schütteln inkubiert. Das Harz wurde mit PBS gewaschen und 5 Minuten lang in 90 µL 100 mM Glycin, pH 2,7, resuspendiert. Der Überstand wurde extrahiert und zu 10 µL sterilem 1 M Tris pH 8,0 gegeben. Die Hefeadsorption wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt7,10. Kurz gesagt, Hefe mit leerem Vektor (pDD003) wurde durch 18-stündige Kultur in 1:10 SDO-Ura:SGO-Ura induziert. 108 induzierte Hefen wurden mit PBE (PBS mit 0,5 % BSA und 0,5 mM EDTA) gewaschen, mit 100 µL gereinigtem IgG resuspendiert und drei Stunden lang bei 4 °C unter Schütteln inkubiert. Von der Hefe abgereichertes IgG wurde aus der Hefe-IgG-Mischung durch 0,45-µm-Filterplatten durch 3-minütige Zentrifugation bei 3000 g eluiert.

Die Auswahl der Hefebibliotheken wurde wie zuvor beschrieben7,10 durchgeführt. Kurz gesagt, die Hefebibliothek Exo201 (akute COVID-19-Kohorte) oder Exo204 (BRI, Yale HCW, CoronaVac, Längsschnittkontrolle und Myokarditis-Kohorte) wurde bei einer OD von 1 induziert und in 1:10 SDO-Ura:SGO-Ura kultiviert 30 °C. Vor der Selektion wurden 58 induzierte Hefen beiseite gelegt, um einen Vergleich der Bibliotheken vor der Selektion und nach der Selektion zu ermöglichen. 108 induzierte Hefe wurde mit PBE gewaschen und in die Vertiefungen einer sterilen Platte mit 96 Vertiefungen gegeben. Zehn Mikrogramm hefeadsorbiertes IgG wurden der Hefebibliothek in zweifacher Ausfertigung in 100 μl PBE hinzugefügt und 1 Stunde lang bei 4 °C inkubiert. Hefe wurde mit PBE gewaschen und mit 1:100 Biotin-Anti-Human-IgG-Fc-Antikörper (Klon HP6017, BioLegend) inkubiert #409308 oder Klon QA19A42, Biolegend #366918) für 30 Minuten. Die Hefe wurde mit PBE gewaschen und mit einer 1:20-Verdünnung von Streptavidin MicroBeads (Nr. 130-048-101, Miltenyi Biotec) 30 Minuten lang inkubiert. Die Hefe wurde in PBE resuspendiert und IgG-gebundene Hefe wurde durch positive magnetische Selektion mit dem MultiMACS M96 Separator (Miltenyi Biotec) gemäß den Anweisungen des Herstellers und wie zuvor beschrieben isoliert7,10. Ausgewählte Hefe wurde in 1 ml SDO-Ura resuspendiert und 24 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.

Die Vorbereitung der NGS-Bibliothek erfolgte wie zuvor beschrieben7,10. Kurz gesagt, DNA wurde aus Hefebibliotheken mit Zymoprep-96 Yeast Plasmid Miniprep-Kits oder Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II-Kits (Zymo Research) gemäß den Standardprotokollen des Herstellers extrahiert. Eine erste PCR-Runde wurde verwendet, um eine DNA-Sequenz zu amplifizieren, die den Protein-Display-Barcode auf dem Hefeplasmid enthielt, wie zuvor beschrieben7,10. Eine zweite PCR-Runde wurde mit 1 µL Schritt-1-PCR-Produkt unter Verwendung von Nextera i5- und i7-Dual-Index-Bibliotheksprimern (Illumina) durchgeführt, wie zuvor beschrieben7,10. PCR-Produkte wurden gepoolt und auf einem 1 %igen Agarosegel laufen gelassen, und die DNA, die der Bande bei 257 Basenpaaren entsprach, wurde geschnitten. DNA (NGS-Bibliothek) wurde mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Standardprotokollen des Herstellers extrahiert. Die NGS-Bibliothek wurde mit einem Illumina NextSeq550 und einem NextSeq-Hochleistungssequenzierungskit mit 75-Basenpaar-Single-End-Sequenzierung gemäß den Standardprotokollen des Herstellers sequenziert. Pro Probe wurden durchschnittlich mindestens 200.000 Lesevorgänge erfasst, und die Vorauswahlbibliothek wurde mindestens zehnmal so tief abgetastet wie andere Proben. Proben mit weniger als 50.000 Lesevorgängen wurden als fehlgeschlagene Sequenzierung verworfen.

Die REAP-Scores wurden wie zuvor beschrieben berechnet7,10. Kurz gesagt, Barcode-Zählungen wurden mithilfe benutzerdefinierter Codes aus NGS-Rohdaten extrahiert und Zählungen aus technischen Replikaten summiert. Als nächstes wurden die aggregierte und klonale Anreicherung mithilfe von EdgeR26 und benutzerdefinierten Codes berechnet. Bei der Aggregatanreicherung handelt es sich um die log2-fache Änderung aller mit einem bestimmten Protein verbundenen Barcodes, summiert in der Post-Bibliothek relativ zur Vor-Bibliothek, mit Nullen anstelle negativer Fold-Änderungen. Die log2-fachen Änderungswerte für die klonale Anreicherung wurden auf identische Weise berechnet, die Barcode-Zählungen aller eindeutigen Barcodes, die mit einem bestimmten Protein verknüpft sind, wurden jedoch nicht summiert. Die klonale Anreicherung für eine bestimmte Reaktivität wurde als der Anteil der Klone an der Gesamtzahl der Klone definiert, die angereichert wurden (log2-fache Änderung ≥ 2). Aggregat (Ea) und klonale Anreicherung (Ec) für ein bestimmtes Protein, ein Skalierungsfaktor (βu), basierend auf der Anzahl einzigartiger Hefeklone (Hefe mit einem eindeutigen DNA-Barcode), die ein bestimmtes Protein aufweisen, und ein Skalierungsfaktor (βf) Basierend auf der Gesamthäufigkeit von Hefen in der Bibliothek, die ein bestimmtes Protein aufweisen, wurden sie als Eingaben zur Berechnung des REAP-Scores verwendet, der wie folgt definiert ist.

βu und βf sind logarithmische Skalierungsfaktoren, die den REAP-Score von Proteinen mit geringer Anzahl eindeutiger Barcodes oder geringer Häufigkeit in der Bibliothek zunehmend benachteiligen und in früheren Veröffentlichungen ausführlich beschrieben werden7,10.

Antigene mit einem durchschnittlichen REAP-Score von mehr als 0,5 über alle Proben hinweg wurden als unspezifische Bindemittel definiert und von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Autoantikörperreaktivitäten wurden als Antigene mit einem REAP-Score >2 und einem zeilen-(antigen-)weisen Z-Score-Schwellenwert >1,96 definiert (sofern nicht anders angegeben).

TMPRSS2-VeroE6-Nierenepithelzellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 1 % Natriumpyruvat (NEAA) und 10 % fötalem Rinderserum (FBS), bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zelllinie wurde negativ auf Kontamination mit Mykoplasmen getestet. Die SARS-CoV-2-Linie A (USA-WA1/2020) wurde von BEI Resources (#NR-52281) bezogen und in TMPRSS2-VeroE6 amplifiziert. Die Zellen wurden 3 Tage lang mit einer MOI von 0,01 infiziert, um einen Arbeitsstamm zu erzeugen. Nach der Inkubation wurde der Überstand durch Zentrifugation (450 g × 5 Min.) geklärt und durch einen 0,45-µm-Filter filtriert. Das pelletierte Virus wurde dann in PBS resuspendiert und zur Lagerung bei –80 °C aliquotiert. Die Virustiter wurden mittels Standard-Plaque-Assay unter Verwendung von TMPRSS2-VeroE6 gemessen. Kurz gesagt, 300 µl serieller Virusverdünnungen wurden verwendet, um Vero E6-Zellen in MEM-supplementiertem NaHCO3, 4 % FBS, 0,6 % Avicel RC-581 zu infizieren. Plaques wurden 48 Stunden nach der Infektion durch einstündiges Fixieren in 10 % Formaldehyd und anschließende Färbung mit 0,5 % Kristallviolett in 20 % Ethanol gelöst. Die Platten wurden mit Wasser gespült, um eine Plaquezählung zu ermöglichen. Alle Experimente wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 mit Genehmigung des Yale Environmental Health and Safety Office durchgeführt.

Der Neutralisationstest wurde wie zuvor beschrieben9 durchgeführt. Kurz gesagt, Seren von geimpften Personen wurden 30 Minuten lang bei 56 °C wärmebehandelt. Sechsfach seriell verdünntes Plasma von 1:10 bis 1:2430 wurde mit SARS-CoV-2-Linie A (USA-WA1/2020) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Mischung zur Adsorption 1 Stunde lang mit TMPRSS2-VeroE6 in einer Platte mit 12 Vertiefungen inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer MEM-supplementierten Mischung aus NaHCO3, 4 % FBS und 0,6 % Avicel überschichtet. Die Plaques wurden 40 Stunden nach der Infektion durch einstündiges Fixieren in 10 % Formaldehyd und anschließendes Färben in 0,5 % Kristallviolett gelöst. Alle Experimente wurden parallel zu Basiskontrollseren in einer etablierten Viruskonzentration durchgeführt, um 60–120 Plaques/Well zu erzeugen.

ELISAs wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt9. Kurz gesagt, Triton . 96-Well-MaxiSorp-Platten (Thermo Scientific #442404) wurden mit 50 μl/Well rekombinantem SARS Cov-2 S Total (ACROBiosystems #SPN-C52H9-100 μg) oder RBD-Protein (ACROBiosystems #SPD-C52H3-100 μg) beschichtet eine Konzentration von 2 μg/ml in PBS und wurden über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Beschichtungspuffer wurde entfernt und die Platten wurden 1 Stunde lang bei RT mit 200 μl Blockierungslösung (PBS mit 0,1 % Tween-20, 3 % Milchpulver) inkubiert. Das Plasma wurde seriell im Verhältnis 1:100, 1:200, 1:400 und 1:800 in einer Verdünnungslösung (PBS mit 0,1 % Tween-20, 1 % Milchpulver) verdünnt und zwei Stunden lang 100 μl verdünntes Serum zugegeben RT. Human Anti-Spike (SARS-CoV-2 Human Anti-Spike (AM006415) (Aktives Motiv #91351) wurde seriell verdünnt, um eine Standardkurve zu erstellen. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T (PBS mit 0,1 % Tween-20) gewaschen. und 50 μl HRP-Anti-Human-IgG-Antikörper (GenScript #A00166, 1:5000), verdünnt in Verdünnungslösung, zu jeder Vertiefung hinzugefügt. Nach 1 Stunde Inkubation bei RT wurden die Platten sechsmal mit PBS-T gewaschen. Die Platten wurden mit entwickelt 100 μl TMB-Substratreagenzset (BD Biosciences #555214) und die Reaktion wurde nach 5 Minuten durch Zugabe von 2 N Schwefelsäure gestoppt. Die Platten wurden dann bei einer Wellenlänge von 450 und 570 nm abgelesen.

ELISAs wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt7. Kurz gesagt, MaxiSorp-Platten mit 96 Vertiefungen (Thermo Scientific #442404) wurden mit 200 ng rekombinantem IL-1RA-Protein (Biolegend #553906) in PBS beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platten wurden herausgenommen und mit 2 % Humanserumalbumin inkubiert (HSA) (Celprogen #HSA2001-25-2) in PBS für 2 Stunden bei RT. Die Platten wurden dreimal mit 200 μl Waschpuffer (PBS 0,05 % Tween) gewaschen. Die Proben wurden in 2 % HSA verdünnt und auf die Platte gegeben, um sie 2 Stunden lang bei RT zu inkubieren. Als Positivkontrolle wurde Maus-Anti-Human-IL-1RA (Prospec #ant-238) verwendet. Die Platten wurden 6x mit Waschpuffer gewaschen. Ziegen-Anti-Human-IgG-Fc (Sigma Aldrich, #AP113P), 1:10.000 in 2 % HSA verdünnt, wurde zu den Platten gegeben und 1 Stunde lang bei RT inkubiert. Für die Positivkontrolle wurde 1:5000 Ziegen-Anti-Maus-IgG-Fc (Thermo Fisher Scientific, Nr. A16088) in 2 % HSA verwendet. Die Platten wurden 6x gewaschen. Die Platten wurden mit 100 μl TMB Substrate Reagent Set (BD Biosciences #555214) entwickelt und die Reaktion wurde nach 5 Minuten durch Zugabe von 2 N Schwefelsäure gestoppt. Anschließend wurden die Platten bei einer Wellenlänge von 450 nm ausgelesen.

Statistische Details zu den Experimenten finden Sie in den Legenden zu den Abbildungen. Alle REAP-Screens, ELISA und Neutralisationstests wurden mit zwei technischen Replikaten durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit R, Python, Excel und GraphPad Prism durchgeführt. Zur Vorbestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Patienten wurden aus der akuten COVID-19-Kohorte ausgeschlossen, wenn sie keine mittelschwere oder schwere Erkrankung aufwiesen oder nur einen einmaligen Zeitpunkt hatten, da dies die für unsere Studie erforderliche Längsschnittanalyse verhindern würde. Patienten wurden aus der Impfkohorte ausgeschlossen, wenn eine unklare Probenbeschriftung oder eine offensichtliche Cross-Well-Kontamination festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde ein Patient aufgrund eines fehlgeschlagenen REAP-Prozesses und fehlender Autoantikörperdaten ausgeschlossen. Zwei Patienten wurden aus der Myokarditis-Kohorte ausgeschlossen: 1 Patient erhielt IVIG vor der Blutentnahme, was die Ergebnisse von REAP erschwert und sie nicht interpretierbar macht; Bei einem Patienten trat 21 Tage nach der Impfung eine Myokarditis auf, was einen atypischen Zeitverlauf darstellt und daher die Ursache der Myokarditis (viral vs. Impfstoff) nicht ermittelt werden konnte. Die Experimente waren nicht randomisiert.

Für die akute COVID-19-Kohorte und die Benaroya-Kohorte wurden vom Prüfer REAP- und ELISA-/Neutralisationsstudien durchgeführt, bevor er zugehörige klinische Anmerkungen erhielt. Für die Yale HCW-Kohorte, die CoronaVac-Kohorte und die Myokarditis-Kohorte erhielt der Prüfer zum Zeitpunkt der REAP-/ELISA-/Neutralisierungsstudien klinische Anmerkungen. Die Proben wurden jedoch auf die gleiche Weise in einem randomisierten Plattenlayout analysiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle in diesem Dokument gemeldeten Daten werden auf Anfrage vom entsprechenden Autor weitergegeben. Alle zusätzlichen Informationen, die zur erneuten Analyse der in diesem Artikel berichteten Daten erforderlich sind, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt.

Der zur Generierung der im Manuskript enthaltenen Ergebnisse und Abbildungen verwendete Code wird auf Anfrage vom entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Suzanne Fischer für die logistische Unterstützung und Jonathan Klein für die hilfreiche Diskussion. Rachel Hartley leistete entscheidende Hilfe bei der Proben- und klinischen Datenverfolgung für die BRI-Kohorte. Wir danken Andrew Pickles, Heather White, Kassidy Benoscek und Kimberly Varner für ihre Arbeit bei der Rekrutierung, Einschreibung und der Durchführung von BRI-Kohortenstudienbesuchen. Carla Greenbaum, MD, beriet die Studie und Uma Malhotra, MD, überwachte das BRI IRB-Protokoll. Wir danken auch den Ärzten und Mitarbeitern der Abteilung für Rheumatologie des Virginia Mason Franciscan Health für ihre Unterstützung bei der Rekrutierung von Studienteilnehmern für die BRI-Kohorte. Abbildung 1A wurde mit BioRender.com erstellt. Diese Arbeit wurde von der Mathers Family Foundation (für AMR und AI), der Ludwig Family Foundation (für AMR und AI) und einer Ergänzung zum Yale Cancer Center Support Grant 3P30CA016359-40S4 (für AMR) unterstützt. IMPACT erhielt Unterstützung vom Yale COVID-19 Research Resource Fund. Die Benaroya Family Foundation, die Leonard and Norma Klorfine Foundation, Glenn und Mary Lynn Mounger sowie Monolithic Power Systems haben BRI für diese Arbeit finanziell unterstützt. AMR wird zusätzlich durch einen NIH Director's Early Independence Award (DP5OD023088) und die Robert T. McCluskey Foundation unterstützt. JRJ wird vom Yale Medical Scientist Training Program T32GM007205 unterstützt. CL ist ein Pew Latin American Fellow. AI ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jillian R. Jaycox, Carolina Lucas, Inci Yildirim.

Abteilung für Immunbiologie, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA

Jillian R. Jaycox, Carolina Lucas, Yile Dai, Eric Y. Wang, Valter Monteiro, Carrie L. Lucas, Akiko Iwasaki und Aaron M. Ring

Abteilung für Pädiatrie, Abteilung für Infektionskrankheiten und globale Gesundheit, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA

Perle Yildirim

Yale Institute for Global Health, Yale University, New Haven, CT, USA

Inci Yildirim & Saad Omer

Zentrum für Interventionelle Immunologie, Benaroya Research Institute in Virginia Mason, Seattle, WA, USA

Sandra Lord & Cate Speake

Virginia Mason Medical Center, Seattle, WA, USA

Jeffrey Carlin & Mariko Kita

Translationales Forschungsprogramm, Benaroya Research Institute in Virginia Mason, Seattle, WA, USA

Jane H. Buckner

Abteilung für Biostatistik, Yale School of Public Health, New Haven, CT, USA

Shuangge Ma

Medizinische Abteilung, Abteilung für Infektionskrankheiten, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA

Melissa Campbell, Albert Ko & Saad Omer

Abteilung für Epidemiologie mikrobieller Erkrankungen, Yale School of Public Health, New Haven, CT, USA

Albert Co & Saad Omer

Howard Hughes Medical Institute, Chevy Chase, MD, USA

Akiko Iwasaki

Abteilung für Pharmakologie, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA

Aaron M. Ring

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JRJ, CL, YD und VM führten Experimente durch. IY stellte Yale HCW- und Myokarditis-Patientenproben und klinische Anmerkungen zur Verfügung. JB, CS, MK, SL und JC stellten BRI-Kohortenproben und klinische Anmerkungen zur Verfügung. JRJ, EYW und CL analysierten Daten. SM sorgte für die Überwachung von Statistiken und Datenanalysen. AK, MC, SO, CS, AI und AMR sorgten für die Projektüberwachung. JRJ und AMR haben den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Cate Speake, Akiko Iwasaki oder Aaron M. Ring.

EYW, YD und AMR sind Erfinder eines Patents, das die REAP-Technologie beschreibt, und AMR ist der Gründer von Seranova Bio. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Review-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Jaycox, JR, Lucas, C., Yildirim, I. et al. SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe entkoppeln die antivirale Immunität von der humoralen Autoimmunität. Nat Commun 14, 1299 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36686-8

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Eingegangen: 01. August 2022

Angenommen: 09. Februar 2023

Veröffentlicht: 09. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36686-8

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