Flavin

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4896 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Epoxidringöffnungsreaktionen sind sowohl in biologischen Prozessen als auch in synthetischen Anwendungen weit verbreitet und wichtig und können auf nicht-redoxische Weise durch Epoxidhydrolasen oder reduktiv durch Oxidoreduktasen katalysiert werden. Hier berichten wir, dass Fluostatine (FSTs), eine Familie atypischer Angucycline mit einem Benzofluoren-Kern, in Gegenwart von Flavinadenindinukleotid (FAD) und Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) nichtenzymkatalysierte Epoxidringöffnungsreaktionen eingehen können. Der 2,3-Epoxidring in FST C öffnet sich nachweislich reduktiv über ein mutmaßliches Enol-Zwischenprodukt oder oxidativ über ein peroxyliertes Zwischenprodukt mit molekularem Sauerstoff als Oxidationsmittel. Diese Reaktionen führen zu mehreren Produkten mit unterschiedlichen Redoxzuständen, die eine einzelne Hydroxylgruppe an C-2, ein 2,3-vicinales Diol, einen kontrahierten fünfgliedrigen A-Ring oder einen erweiterten siebengliedrigen A-Ring besitzen. Ähnliche Reaktionen finden auch in Naturstoffen und anderen organischen Verbindungen statt, die ein Epoxid neben einer Carbonylgruppe enthalten, die an eine aromatische Einheit konjugiert ist. Unsere Erkenntnisse erweitern das Repertoire der bekannten Flavinchemie und könnten neue und nützliche Werkzeuge für die organische Synthese liefern.

Epoxide sind wichtige Bausteine ​​in der organischen Synthese und Biosynthese1,2. Aufgrund der erheblichen Spannung des dreigliedrigen Oxiranrings und der polarisierten Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindungen können Epoxide unter der Kontrolle eines geeigneten Katalysators leicht eine regioselektive und stereoselektive Ringöffnung eingehen3,4. Die Öffnung des Epoxidrings erfolgt im Allgemeinen über eine nukleophile Addition mit Umkehrung der Stereochemie; Die Regioselektivität kann jedoch davon abhängen, ob die Reaktion unter sauren oder alkalischen Bedingungen durchgeführt wird, wie in Abb. 1a5 dargestellt. Dementsprechend wurde eine Reihe von Nukleophilen entwickelt, die mit Epoxiden reagieren und 1,2-difunktionalisierte Systeme mit trans-Stereochemie ergeben6. Die Öffnung des Epoxidrings kann auch durch Enzyme wie Epoxidhydrolasen (EHs) oder Oxidoreduktasen (ORs) katalysiert werden (Abb. 1b)7. EHs katalysieren die Hydrolyse von Epoxiden zu transvicinalen Diolen8,9; ORs katalysieren die stereoselektive Reduktion eines Epoxids zu einem Alkohol (Abb. 1b)10,11.

a Nichtenzymatische Ringöffnungsreaktionen von Epoxiden, die die Zugabe eines Nukleophils (Nuc) unter basischen oder sauren Bedingungen beinhalten. b Enzymatische Epoxidringöffnungsreaktionen durch Epoxidhydrolasen (EHs) und Oxidoreduktasen (ORs). c Epoxidringöffnungsreaktionen von Fluostatin C (1), entweder enzymatisch katalysiert durch die Hydrolase Alp1U oder nichtenzymatisch vermittelt durch FAD und NADH, wie in dieser Studie berichtet.

Epoxide sind auch ein wichtiges Strukturelement, das in einer Vielzahl von Naturstoffen und reaktiven Zwischenprodukten in Biosynthesewegen vorkommt1. Insbesondere die Fluostatine (FSTs, z. B. 1)12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22, Kinamycine23, Lomaiviticine24,25 und Nenestatine26,27,28 bilden eine Familie atypischer Substanzen Angucycline mit einem Benzofluoren-Kern (Ergänzende Abbildung 1). Der Benzofluorenkern der Kinamycine und Lomaiviticine ist außerdem mit einer Diazogruppe versehen, die diesen Verbindungen starke Antitumoraktivitäten verleiht, die große Aufmerksamkeit erregt haben29,30. Die atypischen Angucycline zeichnen sich häufig durch einen stark sauerstoffhaltigen A-Ring aus, der weitere Modifikationen wie Acylierung, Epoxidierung, Glykosylierung und Dimerisierung erfahren kann, was zu einer erheblichen strukturellen Vielfalt führt18,21,27,31,32. Kürzlich wurde berichtet, dass die α/β-Hydroxylasen Alp1U und Lom6 stereoselektive Epoxidhydrolysereaktionen während der Biosynthese von Kinamycinen und Lomaiviticin katalysieren23. Es wurde auch gezeigt, dass Alp1U das Epoxid von FST C (1) hydrolysiert, um die beiden stereoisomeren FSTs C1 (2) und C2 (3) zu ergeben (Abb. 1c)18,33.

Es wurde gezeigt, dass die α/β-Hydrolase FlsH aus dem FST-Weg im aus dem Südchinesischen Meer stammenden Micromonospora rosaria SCSIO N160 die Deacylierung von Acyl-FSTs katalysiert;18 jedoch ist sie trotz ihrer Homologie zu FSTs nicht in der Lage, die Hydrolyse des Epoxids in FSTs zu katalysieren Alp1U18. Es wurde vorgeschlagen, dass natürlich isolierte FSTs (ergänzende Abbildung 1), wie FST B12, Pyrazolofluostatine A‒C16 und FST R17, von den entsprechenden Epoxidvorläufern abgeleitet sind; Angesichts der Aktivität von FlsH ist jedoch nicht ganz klar, wie das Epoxid gespalten würde und welche Enzyme gegebenenfalls dafür verantwortlich wären.

In dieser Arbeit wird gezeigt, dass sich der 2,3-Epoxidring in FST C (1) in Gegenwart von Flavinadenindinukleotid (FAD, 4) und Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) mit reduziertem FADH2 (5) oder C4a- nichtenzymatisch öffnet. Hydroperoxyflavin (FADOOH, 6) dient als reaktive Flavinspezies (Abb. 1c). Die Epoxid-Ringöffnungsreaktionen können daher reduktiv ablaufen und ein mutmaßliches Enol-Zwischenprodukt erzeugen, das zu Produkten mit einer einzelnen Hydroxylgruppe an C-2 (7 und 8) tautomerisiert oder durch 6 weiter zu Produkten mit a modifiziert wird vicinales Diol an C-2 und C-3 (3 und 9). In Gegenwart von molekularem Sauerstoff können die Epoxidringöffnungsreaktionen auch oxidativ ablaufen und zu einem peroxylierten Zwischenprodukt führen, das durch NADH weiter zu 3 und 9 reduziert werden kann, oder es können Ringumlagerungen eingehen, um Produkte mit einer verkürzten fünffachen Bindung zu ergeben. eingliedriger A-Ring (10) oder ein verbrückter und erweiterter siebengliedriger A-Ring (11). Infolgedessen könnte diese nicht-enzymatische Epoxidspaltungsreaktion für die in der Natur beobachtete Bildung mehrerer verschiedener FST-Derivate verantwortlich sein. Weitere Experimente zeigen, dass ähnliche Reaktionen sowohl in Naturstoffen als auch in anderen organischen Verbindungen stattfinden, die ein Epoxid neben einer Carbonylgruppe enthalten, die an eine aromatische Einheit konjugiert ist. Daher ist diese nicht enzymkatalysierte Ringöffnungsreaktion vielversprechend als nützliches Werkzeug in der organischen Synthese.

Es wurde zuvor gezeigt, dass die α/β-Hydroxylase Alp1U das Epoxid von FST C (1) hydrolysiert, um FST C1 (2) und FST C2 (3) zu ergeben (Abb. 2a, Spuren i-ii)18,33. Im Gegensatz dazu ist das Alp1U-Homolog FlsH nicht in der Lage, die Hydrolyse des Epoxidrings in 1 zu katalysieren (Abb. 2a, Spur iii)18. Eine mögliche Erklärung ist, dass FlsH möglicherweise einen Proteinpartner oder einen exogenen Cofaktor benötigt, um die Epoxidhydrolyse zu katalysieren. Um diese Hypothesen zu testen, wurden mehrere Flavinreduktasen, darunter Fre aus E. coli34, ausgewählt, um ihre Kompetenz als mutmaßliche Proteinpartner für FlsH zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die Inkubation von FST C (1) mit FlsH und Fre in Gegenwart von NADH zu mehreren Produkten führte (Abb. 2a, Spur vi). Weitere Experimente zeigten jedoch, dass die Bildung des gleichen Produktsatzes auch in Abwesenheit von FlsH beobachtet wurde (Abb. 2a, Spur vii), was darauf hindeutet, dass Fre allein in der Lage war, die gleiche Zersetzung von FST C (1) zu vermitteln. Darüber hinaus führte auch die Inkubation von 1 mit mehreren anderen Flavoenzymen, darunter FlsO2 (Prejadomycin-Oxidase)35, TiaM (Tiacumicin-Halogenase)36,37 und XiaK (Xiamycin-N-Hydroxylase)38, zum gleichen Ergebnis (ergänzende Abbildung 2). Da die Aktivitäten dieser Flavoenzyme alle auf der Reduktion von FAD durch NADH beruhen, wurde vorgeschlagen, dass das reduzierte Flavin allein als eigentlicher Katalysator für den Verbrauch von FST C (1) dient. Tatsächlich wurden ähnliche Produkte bei der Inkubation von FST C (1) mit FAD und NADH in Abwesenheit jeglicher Enzyme beobachtet, sodass FAD und NADH sowohl ausreichend (Abb. 2a, Spuren viii und xii) als auch notwendig (Abb. 2a, Spuren ix‒xi), um den nichtenzymatischen Abbau von FST C (1) zu erleichtern.

eine HPLC-Analyse von Reaktionen mit Beteiligung von FST C (1). (i) 1 Std.; (ii) 1 + Alp1U; (iii) 1 + FlsH; (iv) 1 + FlsH + Fre; (v) 1 + FlsH + NADH; (vi) 1 + FlsH + Fre + NADH; (vii) 1 + Fre + NADH; (viii) 1 + FAD + NADH; (ix) 1 + Fre; (x) 1 + NADH; (xi) 1 + FAD; (xii) 1 + FAD + NADH. HPLC wurde unter Verwendung einer Umkehrphasen-C18-Säule (i–xi) oder in einer polaren Säule (xii) durchgeführt. Die Reaktionen wurden 30 Minuten lang bei 30 °C in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt, der 5 μM Enzym(e) (Alp1U, FlsH oder Fre), 100 μM FAD und 10 mM NADH enthielt. b Die Röntgenkristallstrukturen von 7 und 10. c Experimentelles ECD-Spektrum von 9 (schwarze Linie) im Vergleich zum B3LYP/TZVP PCM/MeCN // ωB97X/TZVP PCM/MeCN-Spektrum von (1R,2S,3R)-9 (rote Linie). Die Balken stellen Rotationsfestigkeitswerte für die Lösungskonformer mit der niedrigsten Energie dar.

Die Reaktionsprodukte (3 und 7‒11) wurden aus einer vergrößerten Reaktion von FST C (1) mit FAD und NADH isoliert und wie in Abb. 1c gezeigt strukturell charakterisiert. Als erstes Produkt wurde FST C2 (3) identifiziert (ergänzende Abbildung 3 und Tabelle 1), das ebenfalls ein Produkt der Alp1U-katalysierten Hydrolysereaktion ist. Es wurde festgestellt, dass das zweite Reaktionsprodukt 7 (ergänzende Abbildung 4 und Tabelle 2) die gleiche planare Struktur wie FST B aufweist, ein FST, das natürlicherweise aus Streptomyces sp. isoliert wurde. TA-339112 und Streptomyces-Stamm Acta 1383;13 die absolute Konfiguration von FST B wurde jedoch nicht bestimmt12. Die (1R,2R,3S)-Absolutkonfiguration von 7 wurde mit der Lösungs-TDDFT-ECD-Methode ermittelt (ergänzende Abbildung 5) und durch Einkristall-Röntgenanalyse bestätigt (Abb. 2b, CCDC 2036399; ergänzende Tabelle 3). Es wurde festgestellt, dass das dritte Produkt 8 (ergänzende Abbildung 6 und Tabelle 2) die gleiche planare Struktur wie 7 aufweist, und die absolute (1R,2R,3R)-Konfiguration von 8 wurde durch Vergleich der durchgeführten experimentellen und berechneten ECD-Spektren zugewiesen das (1R,2R,3R)-Stereoisomer (Ergänzende Abbildung 7)39. Um die beiden Stereoisomere von FST B zu unterscheiden, wurden 7 und 8 FST B1 bzw. FST B2 genannt (Abb. 1). Das Produkt 9 (bezeichnet als FST C3, Abb. 1) wurde mit der gleichen Retentionszeit wie 3 während der HPLC-Analyse mit einer Umkehrphasen-C18-Säule isoliert. Die Analyse des Assays mit einer polaren HPLC-Säule ermöglichte die Trennung dieser beiden Spezies (Abb. 2a, Spur xii). Schließlich wurde 9 durch HRESIMS- und NMR-Daten als Stereoisomer von 3 identifiziert (ergänzende Abbildung 8 und Tabelle 4), und die absolute (1R,2S,3S)-Konfiguration von 9 wurde durch die TDDFT-ECD-Methode ermittelt (Abb. 2c). , Ergänzende Abb. 9).

Zwei zusätzliche Produkte 10 und 11 wurden ebenfalls identifiziert und strukturell charakterisiert (Abb. 1c; Abb. 2a, Spuren vi-viii und xii). Durch NMR-spektroskopische Analyse wurde festgestellt, dass das Produkt 10 mit der Bezeichnung FST C4 (Abb. 1) einen kontrahierten fünfgliedrigen A-Ring besitzt (ergänzende Abb. 10 und Tabelle 5) und es wurde festgestellt, dass es den absoluten Wert (1R,2R) aufweist Konfiguration durch Einkristall-Röntgenanalyse (Abb. 2b; Ergänzungstabelle 6; CCDC 2129081). Es wurde strukturell aufgeklärt, dass das Produkt 11 mit der Bezeichnung FST C5 (Abb. 1) einen verbrückten und erweiterten siebengliedrigen A-Ring aufweist (ergänzende Abbildung 11 und Tabelle 5). Die Zuordnung der (1R,2R,3R)-Absolutkonfiguration zu 11 basierte auf seiner Herkunft aus 1, bleibt aber ansonsten vorläufig, da eine definitive experimentelle Charakterisierung aufgrund seiner Instabilität nicht möglich war. Derzeit gibt es keine Berichte darüber, dass 9‒11 aus einer natürlichen Quelle isoliert wurde.

Um den Mechanismus der nichtenzymatischen Epoxidringöffnungsreaktion zu untersuchen, wurden FST C (1), FAD und NADH in PBS-Puffer (pH 7,0), hergestellt mit Deuteriumoxid (2H2O), co-inkubiert. Der Einbau eines einzelnen Deuterons in 7 und 8 wurde durch das Vorhandensein eines um + 1 Da verschobenen Molekülionenpeaks bei m/z 326,7 ([M ‒ H]‒) für beide reduzierten Produkte angezeigt (ergänzende Abbildung 12). Im Gegensatz dazu wurden keine Änderungen der Molekulargewichte von 3, 9, 10 oder 11 (ergänzende Abbildung 12) beobachtet. Anschließend wurden 7-2H und 8-2H aus vergrößerten Reaktionen isoliert und mittels 1H- und 13C-NMR analysiert (Ergänzende Abbildungen 13, 14 und Tabelle 2). Ein Vergleich der 1H-NMR-Spektren von 7-2H und 7 ergab, dass das 3-H-Protonensignal von 7 in 7-2H verschwunden war und das 3-Me-Dublett von 7 in 7-2H zu einem Singulett zusammengebrochen war (Abb. 3a). ), das 2H an C-3 von 7-2H lokalisierte. Zur Unterstützung dieser Zuordnung fehlte die in 7 beobachtete COSY-Korrelation zwischen den H-2- und H-3-Protonen in 7-2H (Ergänzende Abbildungen 4, 13). Ebenso wurde auch für 3-Me ein Singulett beobachtet, zusammen mit dem Fehlen jeglicher COSY-Korrelation zwischen H-2 und H-3 in 8-2H (Abb. 3a; ergänzende Abb. 13, 14). Darüber hinaus zeigten die 13C-NMR-Spektren von 7-2H und 8-2H beide eine Verbreiterung und verringerte Intensität der Signale von C-3, und es wurden auch 2H-13C-Kopplungen an C-3 beobachtet (Ergänzende Abbildungen 13, 14)40. Diese Beobachtungen zeigen, dass bei der Reduktion von 1 zu 7 und 8 ein einzelnes Lösungsmittelhydron an C-3 eingebaut wird.

eine NMR-Analyse des 2H- oder 18O-Einbaus in Produkte und Zwischenprodukte sowie möglicher gegenseitiger Umwandlungen. Der Deuteriumeinbau von 7 und 8 aus 2H2O an C-3 wurde aus der 1H-NMR-spektroskopischen Analyse abgeleitet. Die O18-Markierung in 3-18O und 9-18O wurde durch HRMS-Analyse unterstützt. Die zugeordneten Strukturen von 12 und 14 werden gezeigt, während die vorgeschlagene Struktur von 13 aufgrund ihrer geringen Stabilität spekulativ bleibt. b HPLC-Analyse von Reaktionen unter verschiedenen Bedingungen. (i) 1 Std.; (ii) 1 + FAD + NADH (in Luft); (iii) 1 + FAD + NADH (unter 18O2); (iv) 1 + FAD + NADH (unter N2); (v) 7 in 50 mM Borax/NaOH-Puffer (pH 10) bei 30 °C für 12 Stunden; (vi) 100 μM 1 + 10 μM FAD + 2 mM NADH (30 °C für 30 Minuten); (vii‒ix) Inkubation von 13 aus (vi) mit (vii) H2O; (viii) FAD; (ix) FAD + NADH; Die Reaktionen von (viii) und (ix) wurden in O2 bei 30 °C für 30 Minuten in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt; (x) 14 in H2O; (xi) 14 + FAD; (xii) 14 + NADH; (xiii) 14 + FAD + NADH. Die Reaktionen von (x-xiii) wurden 30 Minuten lang bei 30 °C durchgeführt. Die Reaktionen von (xiv–xvii) umfassten die Inkubation von 1 und NADH mit verschiedenen Flavin-Cofaktoren: (xiv) FAD; (xv) FMN; (xvi) Riboflavin; (xvii) Isoalloxazin bei 30 °C für 30 Minuten. (xviii) Die Reaktion, die 1, F420, Glucose-6-phosphat und FGD enthielt, wurde 10 Stunden lang bei 30 °C inkubiert. Die HPLC-Analyse wurde mit UV-Detektion bei 304 nm unter Verwendung einer Polarsäule (Spuren iv und x-xviii) oder einer Umkehrphasen-C18-Säule (Spuren vi-ix) durchgeführt.

Als FST C (1) mit NADH und FAD unter 18O2 inkubiert wurde (Abb. 3b, Spuren i–iii), zeigte die LC-MS-Analyse der Reaktionsprodukte einen Anstieg der Molekülmasse der oxidierten Produkte um +2 Da, was 3 ergab -18O, 9-18O, 10-18O und 11-18O (Abb. 3a; ergänzende Abb. 15). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Umwandlung von 1 in 3, 9, 10 und 11 den Einbau eines Sauerstoffatoms aus O2 beinhaltet. Darüber hinaus war die relative Produktion von 3/9 und 10/11 gegenüber 7/8 O2-abhängig, da die Inkubation von FST C (1) mit FAD und NADH nach Sättigung des Reaktionspuffers mit O2 zu einem signifikanten Anstieg der Spiegel führte ersteres (3, 9‒11) versus letzteres (7 und 8); Im Gegensatz dazu führte die Sättigung des Reaktionspuffers mit N2 zu 7 und 8 als dominanten Produkten (Abb. 3b, Spuren iii und iv). Um die genaue Position des 18O-Einbaus während der Reaktion zu lokalisieren (1 → 3/9), wurde eine vergrößerte Reaktion durch Inkubation von 1, FAD und NADH in 18O2-gesättigtem PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt. Zwei Produkte 3-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0718) und 9-18O ([M ‒ H]‒ m/z 343,0722) (Abb. 3a; ergänzende Abb. 16) wurden isoliert. Die NMR-Analyse zeigte, dass die 18O-Markierung an C-3 von 9-18O eingebaut war (ergänzende Abbildung 17). Insbesondere zeigte der Vergleich der 13C-NMR-Daten für 9 und sein 18O-Isotopologe 9-18O eine 3,8-Hz-Hochfeldverschiebung von δC-3 in letzterem im Vergleich zu 9 (ergänzende Abbildung 18 und Tabelle 4), was die 18O-Markierung unterstützt C-3 (d. h. 9-18O)41,42.

Anschließend wurde die pH-Abhängigkeit der FAD/NADH-abhängigen Zersetzung von 1 untersucht, indem die Reaktion in Puffern im pH-Bereich von 3–10 durchgeführt wurde. Nach der Inkubation von 100 μM 1 mit 100 μM FAD und 10 mM NADH für 2 Stunden bei 30 °C wurde 1 mit Puffern im pH-Bereich von 5–7 effizienter in die Epoxidring-geöffneten Produkte umgewandelt; Allerdings war die Reaktion unter alkalischeren Bedingungen bei pH-Werten von 9–10 weniger effizient (ergänzende Abbildung 19). FST B1 (7) war bei pH 3–7 ziemlich stabil; Bei höherem pH-Wert wandelte es sich jedoch leicht in 8 um (ergänzende Abbildung 20), wo es auch einer Oxidation unterzogen wurde, um das zuvor beschriebene Naturprodukt FST A (12) zu ergeben (Abb. 3b, Spur v; ergänzende Abbildung 20 und Tabelle 1). 12. FST B2 (8) war auch bei pH 3–6 stabil und wurde in alkalischeren Puffern leicht in 7 und 12 umgewandelt (ergänzende Abbildung 20). Im Gegensatz dazu war FST C (1) bei pH 3–10 selbst in Gegenwart von FAD oder NADH allein sehr stabil (ergänzende Abbildung 21), was erneut zeigt, dass die Zersetzung des Epoxids in 1 die Anwesenheit von sowohl FAD als auch NADH erfordert.

Eine Zeitverlaufsanalyse von 100 μM 1 mit 100 μM FAD und 10 mM NADH zeigte die vorübergehende Bildung einer intermediären Spezies 13, die nach längerer Inkubation verschwand (ergänzende Abbildung 22). Eine feste Anfangskonzentration von 1 (100 μM) wurde auch mit unterschiedlichen Konzentrationen von FAD (1, 10 und 100 μM) und NADH (2, 5 und 10 mM) 30 Minuten lang bei 30 ° C inkubiert (ergänzende Abbildung 22). ). Die Lebensdauer des vorübergehenden Zwischenprodukts wurde bei verringerten FAD-Werten erheblich verlängert (Abb. 3b, Spur vi). Dies ermöglichte die Sammlung des Zwischenprodukts 13, gefolgt von einer sofortigen erneuten Injektion auf der HPLC, was seine Umwandlung in 7 und 12 zeigte (Abb. 3b, Spur vii). Als das isolierte Zwischenprodukt 13 sofort mit FAD unter O2 inkubiert wurde, wurde erneut die Produktion von 7 und 12 beobachtet (Abb. 3b, Spur viii); Wenn jedoch auch NADH in die Inkubation einbezogen wurde, wurde stattdessen 3 als Hauptprodukt und 12 als Nebenprodukt beobachtet, und 7 wurde nicht mehr beobachtet (Abb. 3b, Spur ix). Das UV-Absorptionsspektrum des Zwischenprodukts 13 war denen von 1, 3 und 7 sehr ähnlich, und die LC-MS-Analyse des Zwischenprodukts ergab einen m/z-Wert von 325,7 für das [M–H]–-Ion (ergänzende Abbildung 23). . Basierend auf diesen Messungen wird vorläufig vorgeschlagen, dass das Zwischenprodukt das Enol 13 ist (Abb. 3b), das im Wesentlichen ein Tautomer von 7 und 8 ist und daher den gleichen Oxidationszustand wie diese beiden Produkte aufweist.

Während mehrere Versuche unternommen wurden, das Zwischenprodukt zu isolieren, um seine strukturelle Zuordnung als 13 zu bestätigen, wurde nur 7 als Hauptprodukt zusammen mit einer weiteren Nebenverbindung 14 erhalten. Dies steht im Einklang mit der geringen Stabilität des Zwischenprodukts und seiner einfachen Umwandlung in 7 (Abb. 3b, Spur vii, ergänzende Abb. 24). Dennoch konnte 14 charakterisiert werden und wurde somit als das C-3-Peroxid mit der Bezeichnung Hydroperoxyfluostatin identifiziert (Abb. 3a; ergänzende Abb. 25 und Tabelle 5); Allerdings erschwerte die schlechte Wiederfindung von 14 die Sammlung ausreichender Spektren für eine vollständige Charakterisierung seiner absoluten Konfiguration an C-3. Hydroperoxyfluostatin (14) war in Wasser stabil, selbst in Gegenwart von FAD (Abb. 3b, Spuren x und xi). Während die Koinkubation von 14 mit NADH allein zu mehreren Produkten 3, 9, 10 und 11 führte, veränderte der Einschluss von FAD mit NADH das Produktprofil nicht (Abb. 3b, Spuren xii und xiii; ergänzende Abb. 26). Angesichts der beobachteten Umwandlung von 14 in 3 und 9 ist Verbindung 14 wahrscheinlich eine Mischung der Stereoisomere (1S,2S,3R) und (1S,2S,3S). Die Tatsache, dass die Isolierung von 13 eine geringe Menge an 14 lieferte, legt nahe, dass 14 ein weiteres Zwischenprodukt ist, das mit 13 koeluiert und nicht von 13 abgeleitet ist. Darüber hinaus konnten 3/9 sowohl aus 13 als auch aus 14 erzeugt werden, 7/8 jedoch nur hergestellt aus 13, während 10/11 ausschließlich aus 14 abgeleitet wurden (Abb. 3a).

Bei der Berücksichtigung anderer Flavin-bezogener Cofaktoren wurde auch festgestellt, dass FMN und Riboflavin anstelle von FAD die Zersetzung von 1 in Gegenwart von NADH effizient vermitteln (Abb. 3b, Spuren xiv–xvi). Isoalloxazin und NADH konnten ebenfalls die Bildung von 3 aus 1 erleichtern, wenn auch mit einer viel geringeren Effizienz (Abb. 3b, Spur xvii). Bei Verwendung des Cofaktors F420 in Gegenwart des reduzierenden Systems aus Glucose-6-phosphat und F420-abhängiger Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (FGD)43,44,45 wurden nur die Produkte 3, 9–11 beobachtet, jedoch bemerkenswerterweise keine Produktion der reduzierten Spezies 7 und 8 wurde beobachtet (Abb. 3b, Spur xviii). Die Beobachtung des Sauerstoffeinbaus in Gegenwart von F420 und NADH war unerwartet, da reduziertes 5-Deazaflavin im Allgemeinen sehr langsam mit molekularem Sauerstoff reagiert46,47. Dennoch erwiesen sich die in Abb. 3b (Spuren xiv-xviii) gezeigten Ergebnisse mit Flavin-Cofaktor-Kompatibilität als reproduzierbar (ergänzende Abb. 27). Es wurde auch festgestellt, dass NADPH ein wirksamer Cofaktor ähnlich wie NADH ist und somit die Epoxidringöffnungsreaktionen unterstützt (ergänzende Abbildung 19).

Um die Allgemeingültigkeit dieser Reaktion zu untersuchen, wurde eine Reihe von FST-Derivaten 15–21 (Abb. 4) als mögliche Oxiran-Reaktanten getestet. Obwohl FST F (15) gegenüber Alp1U18,33 inert ist, konnte es in Gegenwart von FAD und NADH effizient in 1-O-Methyl-FST C2 (22), 1-O-Methyl-FST B1 (23) umgewandelt werden. 1-O-Methyl-FST C3 (24) und 1-O-Methyl-FST B2 (25) (Abb. 4 und ergänzende Abb. 28), die durch NMR- und ECD-spektroskopische Analyse strukturell charakterisiert wurden (Ergänzungstabellen 7, 8 und Abb. 29–32) sowie Einkristall-Röntgenbeugungsanalyse (z. B. 23, CCDCC 2036400, Ergänzungstabelle 3).

Die FST-Derivate 15–20 könnten bei Behandlung mit FAD/NADH Epoxidringöffnungsreaktionen eingehen, um mehrere mit 3, 7, 8 und 9 verwandte Produkte zu erzeugen. FST Q (21) reagierte nicht mit FAD/NADH. Die Epoxide 28–35 zeigten keine Aktivitäten mit FAD/NADH. Die Behandlung von Auxarthrol H (36) oder Menadion-2,3-epoxid (37) mit FAD/NADH ergab mehrere Produkte. Es wurde festgestellt, dass die Epoxide 42–46 mit FAD/NADH nicht reaktiv waren. Die Oxidoreduktase RslO5 katalysierte während der Rishirilid-Biosynthese eine reduktive Epoxidringöffnungsreaktion an 43 zur Bildung von 44, und es wurde festgestellt, dass Chalkon-α,β-epoxid (46) ein Substrat von RlsO5 war, das das Einzelprodukt 47 ergab.

In ähnlicher Weise könnten auch 7-O-Methyl-FST C (16), 6-O-Methyl-FST C (17), FST D (18), FST S (19) und Difluostatin H (DiFST H, 20) durchlaufen Epoxidringöffnungsreaktionen bei Behandlung mit FAD/NADH, um eine Reihe mehrerer Produkte zu erzeugen, die mit 3, 7, 8 und 9 verwandt sind (Abb. 4, ergänzende Abbildungen 33–37). Die Hauptprodukte von 16 und 17 wurden durch 1D- und 2D-NMR sowie ECD-spektroskopische Analyse als FST M (26)17 bzw. 6-O-Methyl-FST B1 (27) strukturell charakterisiert (Abb. 4, Ergänzungstabelle). 9 und Abb. 38, 39). Die Strukturen der anderen Produkte aus Reaktionen mit 18–20 wurden auf der Grundlage von LC-MS-Analysen abgeleitet. Bemerkenswert ist, dass FST Q (21), das sich von 16 durch ein C-4-Hydroxyl anstelle eines C-4-Carbonyls unterscheidet, mit FAD/NADH nicht reagierte (ergänzende Abbildung 40), was die wesentliche Rolle des C-4-Carbonyls hervorhebt in dieser Chemie.

Die Epoxide 28–37 (Abb. 4) wurden auch als mutmaßliche Oxiransubstrate getestet. Bei 28–35 wurden keine Aktivitäten beobachtet (Ergänzende Abbildungen 41–46)16,40. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung von Auxarthrol H (36)48 mit FAD/NADH zu mehreren Produkten (ergänzende Abbildung 47), von denen eines als 38 bestimmt wurde, das ein Strukturanalogon von Auxarthrol F ist (Abb. 5; ergänzende Abb . 48 und Tabelle 10)49, durch Vergleich mit den experimentellen und berechneten ECD-Spektren von 36 und 38 (Ergänzende Abb. 49). Die Reaktion mit Menadion-2,3-epoxid (37) ergab drei Produkte (Ergänzungstabelle 11 und Abb. 50–53), darunter 3-Hydroxy-3-methyl-2,3-dihydronaphthalin-1,4-dion (39), 2 -Hydroxy-3-methyl-1,4-naphthochinon (40, Phthiokol, charakterisiert durch Röntgenbeugung, CCDC 2036401; Ergänzungstabelle 12) und 3-Methylnaphthalin-1,4-dion (41).

Die Reaktion kann über reduktive und oxidative Wege ablaufen und je nach Vorhandensein von NADH und O2 zu mehreren Produkten unterschiedlicher Redoxzustände führen. Es wird angenommen, dass die Schlüsselumwandlungen in den Reduktionsreaktionen (gelber Hintergrund) ein Flavin-N5-C4′-Addukt (49) zur Bildung des Enol-Zwischenprodukts 13 umfassen, das eine Tautomerisierung zu 7 (Hauptprodukt) oder 8 (Nebenprodukt) und eine Oxidation eingehen kann um 3 (Dur) oder 9 (Moll) zu erzeugen. 7 kann weiter zu 12 autooxidiert werden. Während die oxidative Ringöffnung wahrscheinlich ein Flavin-C4a-O-O-C3′-Addukt (50) umfasst, entsteht das peroxylierte Zwischenprodukt 14 (grauer Hintergrund), das zu 3 und 9 reduziert werden kann durch NADH und weitere Umlagerungen, die zu 10 und 11 führen.

Zwei gemeinsame Strukturmerkmale, die allen Verbindungen gemeinsam sind, die mit FAD/NADH reagieren können, um die Epoxidringöffnungsreaktionen einzugehen, umfassen (i) das Vorhandensein eines Carbonyls neben dem Epoxid und (ii) das Vorhandensein einer aromatischen Einheit neben dem Carbonyl/ Epoxidpaar (Abb. 4). Das Fehlen einer Carbonylgruppe neben dem Epoxidring in 21 und 28–31 könnte für die beobachtete mangelnde Reaktivität verantwortlich sein. Während 36 und 37 in Gegenwart von FAD/NADH eine Ringöffnung eingingen, wurde für 32–35 keine Reaktion beobachtet, obwohl in diesen Verbindungen ein Epoxid/Carbonyl-Paar vorhanden war. Dies impliziert, dass die Konjugation des Carbonyl/Epoxid-Paares an ein aromatisches System auch für die Ringöffnung des Epoxids notwendig ist.

Als mutmaßliches Substrat wurde auch die kommerzielle Verbindung Vitamin K1-2,3-Epoxid (42) getestet, die sowohl ein Epoxid/Carbonyl-Paar als auch einen angrenzenden aromatischen Ring aufweist. Die Inkubation von 42 mit FAD/NADH führte jedoch weder zu Änderungen im TLC-Retentionsprofil noch in den spektroskopischen Eigenschaften, was darauf hindeutet, dass keine Reaktion erfolgt (ergänzende Abbildung 54). Eine aktuelle Studie zeigte, dass das Flavoenzym RslO5 eine Hydrid-vermittelte reduktive Epoxid-Ringöffnungsreaktion katalysierte, um 43 in 44 während der Rishirilid-Biosynthese umzuwandeln (Abb. 4)11. Die Reaktion verlief auf eine Weise, die der Umwandlung von 1 in 7 sehr ähnlich war. Es wurde jedoch bestätigt, dass die Produktion von 44 aus 43 streng RslO5-abhängig war und 43 in Gegenwart von FMN und NADH11 nicht reaktiv war. Eine mögliche Erklärung ist, dass das Vorhandensein einer langen Seitenkette neben dem Epoxid sowohl in 42 als auch in 43 sowohl die Annäherung als auch die Orientierung des Flavins behindern könnte, wodurch geeignete Wechselwirkungen für die Ringöffnung verhindert werden (ergänzende Abbildung 55). Zwei weitere kommerzielle Verbindungen, trans-1,3-Diphenyl-2,3-epoxypropan-1-on (45) und Chalkon-α,β-epoxid (46), erwiesen sich als nicht reaktiv mit FAD/NADH; Allerdings wurde 46, aber nicht 45 von RlsO5 als Substrat akzeptiert, um das einzige Produkt 47 zu ergeben (Ergänzungstabelle 13 und Abb. 56, 57), was darauf hinweist, dass RslO5 nur für eines der beiden Enantiomere spezifisch ist. Der Einbau von Deuterium in 47 wurde bei der RslO5-Reaktion in gepuffertem 2H2O nicht beobachtet, wurde aber tatsächlich beobachtet, als die RslO5-Reaktion in einem gekoppelten Assay entweder mit der Glucosedehydrogenase aus Bacillus megaterium DSM 2894 (BmGDH) durchgeführt wurde, um (S)-[4- 2H]NADH50 oder mit der Glucosedehydrogenase aus Thermoplasma acidophilum ATCC 25905 (TaGDH) zur Bereitstellung von (R)-[4-2H]NADH51, wobei d-[1-2H]Glucose als Deuteriumdonor verwendet wird (Ergänzende Abb. 58). )52. Frühere Studien zeigten, dass die RslO5-H172N-Mutante einen Mangel an FMN-Bindung aufwies und mit dem nativen Substrat 4311 inaktiv war, was auf die entscheidende Rolle von FMN in der RslO5-katalysierten Reaktion schließen lässt. Insgesamt wird angenommen, dass ein Hydrid von FMNH2, das aus NADH stammt, das wirksame Nukleophil für RslO5-katalysierte Epoxidöffnungsreaktionen ist. Im Gegensatz dazu wurde bei Reaktionen von 1 und FAD mit entweder (S)-[4-2H]NADH oder (R)-[4-2H]NADH, die wie oben beschrieben erzeugt wurden, kein Deuteriumeinbau in 7 beobachtet (Ergänzende Abbildungen 58, 59). ). Daher unterscheidet sich die nichtenzymatische Reduktion von 1 zu 7 in Gegenwart von FAD/NADH von der der RslO5-Katalyse hinsichtlich des letztendlichen Ursprungs des C-3-Wasserstoffs.

Ringöffnungsreaktionen von Epoxiden sind häufig und wichtig sowohl in biologischen Prozessen als auch in synthetischen Anwendungen1,2. Nichtenzymatische Epoxid-Ringöffnungsreaktionen sind typischerweise redoxneutral und verlaufen durch nukleophile Addition, wobei die bevorzugte Regioselektivität und Stereoselektivität von der Art des Epoxids und den Reaktionsbedingungen abhängt, um im Allgemeinen Produkte mit einem trans-vicinalen Diol zu ergeben3,4. Eine ähnliche Chemie findet man bei den α/β-Epoxidhydrolasen, die ebenfalls trans-vicinale Diolprodukte erzeugen53. Beispielsweise katalysiert die Hydrolase AlpU die Epoxidhydrolyse des FST C (1)-Epoxids zu 2 und 3, die jeweils ein trans-vicinales Diol aufweisen (Abb. 1)33. Im Gegensatz dazu wurde kürzlich berichtet, dass das Flavoenzym RslO5 eine reduktive Epoxidringöffnung von Rishirilid katalysiert und dabei ein monohydroxyliertes Produkt ergibt11. Die RslO5-Chemie unterscheidet sich somit deutlich von der der zuvor beschriebenen Hydrolysereaktionen und stellt stattdessen die Hydrierung eines Epoxids durch reduziertes Flavin dar, was aus den Ergebnissen unter Verwendung isotopenmarkierter Substrate hervorgeht (ergänzende Abbildung 58).

In dieser Studie wird gezeigt, dass FAD/NADH die Ringöffnung geeignet aktivierter Epoxide induziert, was zu einer Vielzahl von Produkten mit unterschiedlichen Redoxzuständen führt. Unter anaeroben Bedingungen verläuft die Epoxidringöffnung in Gegenwart von FAD/NADH reduktiv über einen Mechanismus, der möglicherweise nichts mit dem der RslO5-Katalyse zu tun hat. Die resultierenden monohydroxylierten Spezies sind jedoch sehr anfällig für Oxidation durch molekularen Sauerstoff, was in Reaktionen zu Chinonen (z. B. 12) und vicinalen Alkoholen führt, die auch durch die Anwesenheit von FAD beschleunigt werden können. Unter aeroben Bedingungen scheint die Öffnung des Epoxidrings über die Bildung einer α-ketoperoxylierten Spezies zu erfolgen, die durch NADH reduziert werden kann, um wiederum vicinale Diole zu erzeugen. Alternativ kann das peroxylierte Zwischenprodukt einer weiteren Umlagerung unterzogen werden, die sowohl zu ringverengten (z. B. die fünfgliedrige Spezies 10) als auch zu ringexpandierten (z. B. die siebengliedrige Spezies 11) oxidierten Produkten führt.

Auf der Grundlage der gesammelten experimentellen Erkenntnisse wird ein mutmaßlicher Mechanismus für die durch FAD/NADH ermöglichten nichtenzymatischen Epoxidringöffnungsreaktionen vorgeschlagen (Abb. 5). Da für die beobachteten Epoxidringöffnungsreaktionen sowohl FAD als auch überschüssiges NADH erforderlich sind, wird NADH als Reduktionsmittel und FAD als Redoxkatalysator vorgeschlagen. Wenn die Reaktion aerob durchgeführt wird, soll O2 als Oxidationsmittel wirken. Da NADH allein die Reaktion nicht auslösen konnte, wird angenommen, dass das reduzierte Flavin die Spezies ist, die direkt für die Reduktion von 1 verantwortlich ist. Es ist möglich, dass 7 direkt über einen Hydridtransfer von einer reduzierten Flavinspezies (z. B. N5-H) gebildet wird von FADH2) an C3 von 1, wodurch der Epoxidring geöffnet wird, was der durch RslO5 katalysierten Epoxidreduktionsreaktion ähneln würde (Abb. 4). In diesem Fall könnte die Beobachtung, dass das H-3 des Produkts 7 vom Lösungsmittel stammt, durch den leichten Austausch von N5-H des reduzierten Flavins mit dem Lösungsmittel erklärt werden. Dies würde bedeuten, dass 7 das unmittelbare Reduktionsprodukt vor der Tautomerisierung zum beobachteten Zwischenprodukt 13 sein sollte. Ein Zeitverlaufstest mit 0,5 μM 1 mit 10 μM FAD und 2 mM NADH zeigte jedoch, dass sich 13 zuerst anreichert, gefolgt von der Umwandlung in 7 und 8 Im Gegensatz dazu wurde bei Inkubationen von 7 unter ähnlichen Bedingungen keine signifikante Akkumulation von 13 beobachtet (ergänzende Abbildung 60). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 13 das anfängliche Reduktionsprodukt und nicht 7 oder 8 ist und dass die nichtenzymatische Reduktion von 1 in Gegenwart von FAD/NADH nicht über einen direkten Hydridtransfer auf C-3 verläuft, wie dies für die RslO5-Katalyse vorgeschlagen wird.

Ein alternativer Mechanismus beinhaltet die Aktivierung des Oxirans durch das benachbarte Carbonyl, das an einen aromatischen Ring gekoppelt ist, und eine Reduktion, die zu einem instabilen Zwischenprodukt führt. Bei diesem Zwischenprodukt handelt es sich wahrscheinlich nicht um 7-Demethyl-FST Q (48) (Abb. 4), das das Produkt einer direkten C-4-Carbonylreduktion in 1 ist, da das zuvor isolierte FST Q (21)17 gegenüber dem inert ist FAD/NADH-Reaktionssystem (Ergänzende Abb. 40). Stattdessen wird angenommen, dass das Zwischenprodukt während der Reduktion von FST C (1) eine Enolspezies wie 13 ist, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass 13 leicht zu 7 und 8 tautomerisiert. Dieser Mechanismus steht auch im Einklang mit dem Einbau von Deuterium bei H-3 von 7 und 8, wenn die Reaktion in 2H2O durchgeführt wird. Es wird auch erwartet, dass Verbindung 13 anfällig für eine Autoxidation ist, die zu 3 und 9 führt, und zwar auf eine Art und Weise, die empfindlich auf die Anwesenheit von O2, FAD und NADH reagiert.

Die Bildung von 13 kann über die Addition des nukleophilen N-5 des reduzierten Flavins an 1 erfolgen. Dieses Modell wird durch die Tatsache gestützt, dass bei Verwendung des reduzierten F420-Cofaktors, dem das nukleophile N-5 fehlt, das aber vorhanden ist, keine Bildung von 7 beobachtet wurde immer noch in der Lage, als Hydriddonor zu dienen54. Die nukleophile Addition von FADH2 an 1 kann entweder an C-3 oder C-4 erfolgen. Angesichts des Vorhandenseins einer sterisch anspruchsvollen CH3-Gruppe an C-3 von 1 wird angenommen, dass C-4 der wahrscheinliche Ort des nukleophilen Angriffs ist, was mit der Notwendigkeit einer Carbonylgruppe neben dem Epoxid und damit der unterschiedlichen Reaktivität von 16 übereinstimmt (C-4-Carbonyl) gegenüber 21 (C-4-Hydroxyl). Wenn man bedenkt, dass N-5 in FADH2 ein freies Elektronenpaar besitzt und C-4 in 1 ein trigonaler Carbonylkohlenstoff ist, wird angenommen, dass die Redoxreaktion über eine n→π*-Wechselwirkung abläuft. Insbesondere spendet das nukleophile N-5 die Elektronendichte des freien Elektronenpaars (n) in das trigonale Carbenzentrum (leeres π*-Orbital) entlang der Burgi-Dunitz-Trajektorie55. Die Vermischung dieser Orbitale ist thermodynamisch günstig und führt zu einem kovalenten Addukt 49 (Abb. 5)56. Die anschließende N-1-Deprotonierung der Flavin-Einheit in 49 führt zum Aufbrechen der N5-C4'-Bindung und zur Freisetzung des oxidierten Flavins, wodurch die Reduktion von 1 zum Enol-Zwischenprodukt 13 mit einer Δ3,4-Doppelbindung abgeschlossen wird (Abb. 5). ).

Das Zwischenprodukt 13 ist äußerst instabil und unterliegt einer leichten Tautomerisierung, um am α-Kohlenstoff (C-3) entweder von der si-Seite (der Hauptweg) oder der re-Seite (der Nebenweg) der sp2-Planarstruktur ein Lösungsmittelwasserstoffatom einzubauen ergibt 7 bzw. 857. Dieser Mechanismus steht im Einklang mit dem ortsspezifischen Einbau von Deuterium an C-3 in 7 und 8 aus gepuffertem 2H2O (Abb. 3a). Trotz der 2,3-cis-Konfiguration von 7 im Vergleich zu 8 scheint ersteres das thermodynamisch bevorzugte Tautomer mit einer Gleichgewichtskonstante von ungefähr [7]eq/[8]eq = 5,4 zu sein (ergänzende Abbildung 61). Darüber hinaus sind 7, 8 und das mutmaßliche Enol-Zwischenprodukt 13 auch anfällig für eine Autooxidation unter Bildung von 12 (ergänzende Abbildung 62).

Das mutmaßliche Enol-Intermediat 13 scheint auch empfindlich gegenüber molekularem Sauerstoff zu sein und kann in Gegenwart von FAD und NADH einer Autoxidation unterliegen. Reduziertes Flavin reagiert bekanntermaßen mit O2 unter Bildung des kovalenten Fl4aOOH-Addukts (FAD → FADOOH)58, und in einigen Fällen kann H2O2 aus FADOOH freigesetzt werden, um als Oxidationsmittel zu dienen37,59. Allerdings können weder 1 noch 13 mit H2O2 reagieren (Ergänzende Abbildungen 24, 63). Daher wird vorgeschlagen, dass das Zwischenprodukt 13 mit der elektrophilen C(4a)-Hydroperoxygruppe von FADOOH reagiert, um die C-3-monooxygenierten Produkte zu ergeben (siehe ergänzende Abbildung 64). Die Hydroxylierung kann entweder von der si-Seite (Hauptroute) oder der re-Seite (Nebenroute) der planaren Doppelbindung (Δ3,4) erfolgen, um 3 bzw. 9 zu erzeugen, wobei gleichzeitig das oxidierte Flavin freigesetzt wird (Abb. 5). . Der vorgeschlagene Mechanismus wird durch die Beobachtungen gestützt, dass (i) das in 3 und 9 an C-3 eingebaute O aus O2 stammt und (ii) die Umwandlung von 13 in 3 und 9 die Anwesenheit von FAD, NADH und O2 erfordert.

Die Isolierung des Zwischenprodukts 14 weist darauf hin, dass 3 und 9 auch auf alternative Weise ohne Beteiligung von 13 hergestellt werden können. In Gegenwart von molekularem Sauerstoff kann das Flavin-C(4a)-Peroxid (FADOO‒) als Nukleophil für den regioselektiven Angriff dienen C-3 von 1 entweder an der si-Seite (Hauptroute) oder der re-Seite (Nebenroute), um den Epoxidring zu öffnen, was zum mutmaßlichen Addukt 50 führt (Abb. 5). Das Vorhandensein des C-4-Carbonylsauerstoffs mit elektronenziehender Wirkung kann zu Änderungen der Elektronendichte von C-360 führen, wodurch C-3 eine bessere Stelle für nukleophile Substitutionen wird als C-2 des Epoxids in 1. Deprotonierung des Flavin N-5 in 50 bricht die kovalente C4a-O-Bindung und setzt 14 und FAD frei (Abb. 5). Das Produkt 14 ist eine Mischung aus C-3-Isomeren und kann durch NADH leicht zu 3 und 9 reduziert werden (Abb. 5, ergänzende Abb. 65). Die gleichzeitige Inkubation von 14 mit NADH führt auch zu 10 und 11, woran vermutlich ein Baeyer-Villiger-Reaktionsmechanismus beteiligt ist. Das C-3-Hydroperoxid in 14 kann somit eine intramolekulare nukleophile Addition am C-4-Carbonyl durchführen, um das mutmaßliche Zwischenprodukt 51 zu bilden, das sich unter Bildung von 10 und 11 aufteilen kann. Im ersteren Fall kann das Zwischenprodukt 51 eine Criegee-Umlagerung durchlaufen, um eine Ausbeute zu ergeben ein siebengliedriger Lactonring61,62, gefolgt von einer intramolekularen Addition der C-1-Hydroxygruppe an die C-4-Carbonylgruppe, die nach Dehydratisierung zu 10 führt (Abb. 5)63. Alternativ kann die 1,2-Dioxetan-Einheit von 51 einer heterolytischen Spaltung unterzogen werden, gefolgt von einer Grob-ähnlichen Fragmentierung, um ein Oxoheptanoat-Zwischenprodukt zu ergeben64,65, das schließlich nach aufeinanderfolgenden intramolekularen Cyclisierungen und Dehydratisierung66 das Halbacetal 11 erzeugt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die reduktive Epoxidringöffnung mechanistisch über ein transientes Addukt (49) mit einer kovalenten N5‒C4'-Bindung verläuft, die zwischen N-5 des Flavin-Cofaktors und C-4 des Substrats FST C gebildet wird ( 1) (Abb. 5). Während die Tautomerisierung des resultierenden Produkts 7 und 8 ergeben kann, kann eine nukleophile Reaktion mit FADOOH auch die Diolprodukte 3 und 9 ergeben. Die oxidative Epoxidringöffnung von 1 erzeugt das Zwischenprodukt 14 über ein mutmaßliches kovalentes C4a‒O‒O‒C3'-Addukt ( 50, Abb. 5). Die kanonische Reaktivität von Flavin-Cofaktoren beinhaltet in den meisten Fällen Redoxchemie durch N-5-Hydridtransfer oder Sauerstoffaktivierung an C-4a67. Es wurde jedoch berichtet, dass einige Flavoenzyme die Bildung kovalenter Flavin-N-5-Substrat-Addukte auf redoxneutrale Weise katalysieren68, darunter die Iminiumaddukte im Katalysezyklus der UDP-Galactopyranose-Mutase69 und der Alkyl-Dihydroxyacetonphosphat-Synthase70 , Flavin-Prenyltransferase71, Thymidylat-Synthase72 und 2-Halogenacrylat-Hydratase73.

Die vorliegende Studie liefert ein Beispiel, das wahrscheinlich die Bildung von Flavin-N-5-Addukten während Flavin-katalysierter nichtenzymatischer Reaktionen betrifft (Abb. 5). Darüber hinaus wird angenommen, dass das Flavin-C(4a)-Peroxid (FADOO‒) nicht nur als Nukleophil bei der Vermittlung von Hydroxylierung, Epoxidierung und Baeyer-Villiger-Oxidation in der Flavoenzym-Katalyse58 dient, sondern auch die Bildung peroxylierter Zwischenprodukte wie 14 erleichtert (Abb . 5). Es ist bekannt, dass Flavin und Flavinderivate als Cofaktoren an einer Vielzahl von in der Natur vorkommenden Reaktionen beteiligt sind67,74. Frühere Berichte haben gezeigt, dass natürliche Flavine die nichtenzymatische oxidative Decarboxylierung von Picolinsäurederivaten75 und die nichtenzymatische Jodierung verschiedener aromatischer Verbindungen37,59 katalysieren können. In dieser Studie wird die Chemie der Flavine auf Epoxid-Ringöffnungsreaktionen sowohl auf reduktive als auch auf oxidative Weise ausgeweitet, um mehrere ringgeöffnete Produkte zu erzeugen. Folglich könnte die in dieser Studie identifizierte Flavinchemie auf andere Epoxide anwendbar sein und daher als nützliches Werkzeug in der organischen Synthese vielversprechend sein.

Für die Isolierung von FSTs15 wurde der Stamm Micromonospora rosaria SCSIO N160 verwendet. FST Q (21) wurde zuvor aus Streptomyces sp. isoliert. PKU-MA0004517. Chemikalien, Enzyme und andere molekularbiologische Reagenzien wurden aus handelsüblichen Quellen bezogen und gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet.

Die HPLC-Analyse der Reaktionen wurde im Allgemeinen auf einem Gerät der Agilent 1260 Infinity-Serie (Agilent Technologies Inc., USA) unter Verwendung einer Umkehrphasen-C18-Säule (Kinetex® 5 µm C18 100 Å, LC-Säule 150 × 4,6 mm, Phenomenex, USA) oder durchgeführt eine polare Säule (Comixsep®, P/N FMG-BPF5-EONU, Polar BiPFP 5 u, 250 × 4,6 mm, China) mit UV-Detektion bei 256 oder 304 nm unter dem folgenden Programm: Lösungsmittel A, 10 % Acetonitril (MeCN) in Wasser, ergänzt mit 0,1 % Ameisensäure; Lösungsmittel B, 90 % MeCN in Wasser; 5 % B bis 80 % B (0–20 Min.), 80 % B bis 100 % B (20–21 Min.), 100 % B (21–24 Min.), 100 % B bis 5 % B (24–25 Min.) ), 5 % B (25–30 Min.); Durchflussrate bei 1 mL min−1.

Das DNA-Fragment von rslO5 (GenBank: KJ437438.1 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1]) aus dem Rishirilid-Biosynthese-Gencluster in Streptomyces bottropensis11 wurde synthetisiert und in pET28a kloniert, um es zu liefern das Plasmid pCSG8112 (Ergänzungstabelle S14). Als die Kulturen von E. coli BL21(DE3)/pCSG8112 in LB-Medien, die Kanamycin (50 μg mL−1) enthielten, bei 37 °C bis zu einer OD600 von etwa 0,6 gezüchtet wurden, wurde die Produktion von RslO5 durch die Zugabe von Isopropyl- induziert. β-d-Thiogalactopyranosid (IPTG) auf eine Endkonzentration von 0,1 mM. Die Kulturen wurden weitere 12 Stunden bei 16 °C gezüchtet. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation gesammelt und zur Ultraschallbehandlung im Lysepuffer (20 mM Tris-Cl, 500 mM NaCl und 5 mM Imidazol, pH 8,0) resuspendiert. Die Reinigung von N-His6-markiertem RslO5 wurde mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie gemäß dem Handbuch des Herstellers (Novagen, USA) durchgeführt. Nach dem Entsalzen mit einer PD-10-Säule (GE Healthcare, USA) wurde das gereinigte RslO5 im Lagerpuffer (10 % Glycerin, 1 mM DTT, 50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, pH 8,0) bei –80 °C gelagert zur weiteren Verwendung. Die Expression und Reinigung von Fre34, Alp1U18, FlsH18, XiaK38, TiaM36 und FlsO235 wurden ähnlich wie für RslO5 beschrieben durchgeführt. Die Standard-In-vitro-Enzymtests (Alp1U, FlsH, Fre, XiaK, TiaM, Fre oder FlsO2) enthielten 100 μM FST C (1) und 10 μM gereinigtes rekombinantes Enzym in 50 mM PBS-Puffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) (pH 7,0). ) in einem Gesamtvolumen von 100 μL mit Inkubation bei 30 °C für 0,5–2 Stunden. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μl eiskaltem MeOH gestoppt und mit den allgemeinen analytischen HPLC-Methoden überwacht.

Eine typische Reaktionsmischung umfasste 100 µM 1, 100 µM FAD und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 µL mit Inkubation bei 30 °C für 0,5–2 Stunden. Im Allgemeinen wurden die Reaktionen durch Zugabe von 100 μl eiskaltem MeOH beendet und mittels HPLC unter Verwendung der allgemeinen analytischen HPLC-Methode analysiert oder einer LC-MS-Analyse unterzogen. Für Reaktionen unter anaeroben Bedingungen wurden die Reaktionspuffer vor der Zugabe von 1 5 Minuten lang in N2 gespült, mit Parafilm verschlossen und während der 30-minütigen Inkubation bei 30 °C mit N2 gespült. Für Reaktionen unter aeroben Bedingungen wurden die Reaktionspuffer vor der Zugabe von 1 5 Minuten lang in O2 gespült, mit Parafilm verschlossen und während der 30-minütigen Inkubation bei 30 °C mit O2 gespült. Für Isotopenmarkierungsreaktionen mit 2H wurde jede Reaktion in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt, der mit deuteriertem Wasser (2H2O) zubereitet wurde. Für Isotopenmarkierungsreaktionen mit 18O2 wurde eine Reaktionsmischung, die 100 µM FAD und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) enthielt, entgast und 5 Minuten lang mit 18O2 gespült; Nach der Zugabe von 100 µM 1,18O2-Gas wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln kontinuierlich Gas in die Reaktionsmischung eingeleitet.

Zur Bestimmung der pH-Auswirkungen auf die Reaktionen wurden die Tests in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit 100 μM 1, 100 μM FAD und 10 mM NADH in 50 mM Puffern mit pH-Werten im Bereich von 3 bis 10 bei Inkubation bei 30 °C durchgeführt für 2 Std. Die Puffer wurden wie folgt hergestellt: Zitronensäure/Na2HPO4-Puffer (pH 3–6); PBS-Puffer (pH 7); Borsäure/Borax-Puffer (pH 8–9), Borax/NaOH-Puffer (pH 10). Als Kontrollen wurden 100 μM 1 in unterschiedlichen pH-Puffern (pH 3–10) in Gegenwart von 100 μM FAD allein (oder 10 mM NADH allein) 2 Stunden lang bei 30 °C inkubiert.

Für den Zeitverlaufstest wurden die Reaktionen durch Inkubation von 100 µM 1, 100 µM FAD und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) bei 30 °C mit Probenahme zu verschiedenen Zeitpunkten von 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25 und 30 Minuten. Um die Auswirkungen unterschiedlicher FAD/NADH-Konzentrationen zu untersuchen, wurden Reaktionen mit 100 µM 1 in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) mit unterschiedlichen Konzentrationen an FAD und NADH durchgeführt. Der erste Reaktionssatz wurde mit 100 μM 1, 1 μM FAD und 2 (oder 5 oder 10 mM) NADH durchgeführt. Der zweite Reaktionssatz wurde mit 100 μM 1, 10 μM FAD und 2 (oder 5 oder 10) mM NADH durchgeführt. Der dritte Reaktionssatz wurde mit 100 μM 1, 100 μM FAD und 2 (oder 5 oder 10) mM NADH durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wurden 30 Minuten lang in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) bei 30 °C inkubiert.

Um die Cofaktorkompatibilität zu testen, wurden Assays mit 100 μM 1, 100 μM FAD (oder FMN/Riboflavin/Isoalloxazin) und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 μL bei 30 °C inkubiert 30 Minuten. Zum Testen von F420 als Cofaktor werden Tests mit 100 μM 1.200 μM F420, 2,5 mM Glucose-6-Phosphat und 10 μM F420-abhängiger Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (FGD) in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) benötigt ) in einem Gesamtvolumen von 100 μL wurden 1 Stunde bei 30 °C inkubiert.

Die FAD/NADH-vermittelten Epoxidringöffnungsreaktionen wurden mit verschiedenen Substraten getestet, darunter sowohl die FST-verwandten Substrate 15–21 als auch die FST-nicht-verwandten Substrate 28–37, 42, 45 und 46. Eine typische Reaktionsmischung enthält 100 µM Substrat (15). ‒21, 28–37, 42, 45 oder 46), 100 µM FAD und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 µL.

Um die Reaktivität von H2O2 mit FST C (1) zu testen, wurden die Tests in einem Gesamtvolumen von 100 μl mit 100 μM 1 und 30 % H2O2 in 50 mM Puffern bei pH 3,0 (oder pH 7,0 oder pH 10,0) durch Inkubation bei durchgeführt 2 Stunden bei 30 °C.

Eine vergrößerte Reaktion von 1 in einem Gesamtvolumen von 1 l wurde in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0), der 100 μM 1, 10 mM NADH und 100 μM FAD enthielt, bei 30 °C für 2 Stunden unter gelegentlichem Schütteln durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens eiskalten Butanons gelöscht und 20 Minuten lang bei 4 ° C und 2057 × g zentrifugiert. Anschließend wurden die Reaktionsmischungen dreimal mit dem gleichen Volumen Butanon extrahiert und die Lösungsmittel im Vakuum auf einem Eisbad entfernt. Die Rohextrakte wurden in 1,5 ml MeOH gelöst und einer semipräparativen HPLC unter Verwendung einer Agilent Eclipse XDB-C18-Säule (250 mm × 9,4 mm, 5 μm; Agilent Technology Ltd., USA) mit einem isokratischen Elutionsgradienten von 70 % A unterzogen (H2O mit 0,8 % Ameisensäure) und 30 % B (MeCN) bei einer Flussrate von 2,5 mL min−1. Auf diese Weise wurden die Verbindungen 3 (8,5 mg, 22,0 %), 7 (22,0 mg, 57,0 %), 8 (6,0 mg, 15,5 %), 9 (2,6 mg, 6,7 %), 10 (1,6 mg, 4,1 %) und Es wurden 11 (3,4 mg, 8,8 %) erhalten. In ähnlicher Weise ergab eine Reaktion im 40-ml-Maßstab mit 100 μM FST F (2) 22 (2,0 mg, 15 %), 23 (6,0 mg, 46,0 %), 24 (0,9 mg, 7,0 %) und 25 (1,2 mg, 9,0 %). Die Reaktionen im 30-ml-Maßstab von 16, 17 oder 36 ergaben 26 (1,3 mg, 44,0 %), 27 (1,5 mg, 46,0 %) bzw. 38 (1,3 mg, 67,0 %). Eine Reaktion von 37 im 30-ml-Maßstab ergab 39 (1,8 mg, 11,0 %), 40 (4,8 mg, 30,0 %) und 41 (4,3 mg, 27,0 %).

Zur Isolierung von 3-18O und 9-18O wurde eine 400-ml-Reaktion von 1 unter 18O2, bestehend aus 100 µM 1, 100 µM FAD und 10 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0), durch Inkubation durchgeführt bei 30 °C für 2 Stunden. Die Reaktionsprodukte wurden mittels semipräparativer HPLC wie oben beschrieben gereinigt, um 3-18O (3,0 mg, 33,0 %) und 9-18O (1,2 mg, 16,0 %) zu ergeben. Zur Isolierung von 7-2H und 8-2H wurde eine 400-ml-Reaktion zur Isotopenmarkierung mit 2H in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt, der mit gepuffertem 2H2O zubereitet wurde und 100 µM 1, 100 µM FAD und enthielt 10 mM NADH, durch Inkubation bei 30 °C für 2 Stunden. Die Reaktionsprodukte wurden mittels semipräparativer HPLC gereinigt, um 7-2H (11,5 mg, 65,0 %) und 8-2H (3,2 mg, 19,0 %) zu ergeben.

Eine Reaktionsmischung, die 100 µM 1, 10 µM FAD und 2 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 µL enthielt, wurde 20 Minuten lang unter normaler Atmosphäre bei 30 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μL eiskaltem MeOH gelöscht. Um die Stabilität von 13 zu überprüfen, wurde das Zwischenprodukt 13 aus einem allgemeinen analytischen HPLC-Lauf gesammelt und sofort zur HPLC-Analyse erneut injiziert. Um die Veränderungen von 13 unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen, wurde das frisch gesammelte 13 sofort in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) inkubiert, der (i) 10 µM FAD; (ii) 30 % H2O2; (iii) 2 mM NADH; (iv) 10 µM FAD und 2 mM NADH (in Gegenwart eines Überschusses an O2) bei 30 °C für 30 Minuten. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 μl eiskaltem MeOH gelöscht und mit der allgemeinen analytischen HPLC-Methode unter Verwendung einer C18-Säule sowie einer Polarsäule überwacht.

Es wurden vergrößerte Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 50 ml (100 µL × 500 Eppendorf-Röhrchen) mit 100 µM 1, 10 µM FAD und 2 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) bei 30 °C für 20 Minuten durchgeführt Ziel war es, 13 zur Strukturaufklärung zu isolieren. Die Reaktionen in jedem Eppendorf-Röhrchen wurden durch dreimaliges Extrahieren mit 100 μl eiskaltem Butanon gestoppt und die Lösungsmittel wurden unter Vakuum auf einem Eisbad entfernt. Die Rohextrakte wurden dann gesammelt und in 1,0 ml MeOH gelöst und einer allgemeinen analytischen HPLC unter Verwendung einer polaren Säule unterzogen. Die Sammlungen wurden vor der Lyophilisierung bei –80 °C aufbewahrt. Die gesammelten Fraktionen wurden ein zweites Mal gereinigt, um 7 zu entfernen, das bei der Zersetzung von 13 entstanden war. Dieser Prozess lieferte schließlich eine reine und stabile Verbindung (0,8 mg), die zur NMR-Analyse in DMSO-d6 gelöst und bestätigt wurde 14.

Eine Reihe von Tests wurde durchgeführt, um die Stabilität von 14 zu überprüfen. Eine typische Reaktionsmischung enthielt 100 µM 14, 10 µM FAD und 2 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 µL. Kontrollreaktionen wurden parallel durchgeführt, indem FAD oder NADH in den Tests weggelassen wurden. Eine Co-Inkubation von 100 µM 14 in 30 % H2O2 wurde ebenfalls in einem Gesamtvolumen von 100 µL durchgeführt. Die Reaktionsmischungen wurden 30 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Die Reaktionen wurden nach Zugabe von 100 μl eiskaltem MeOH gelöscht und mittels HPLC unter Verwendung einer polaren Säule nach der allgemeinen analytischen HPLC-Methode analysiert.

Eine Standard-RslO5-In-vitro-Reaktionsmischung enthielt 100 μM trans-1,3-Diphenyl-2,3-epoxypropan-1-on (45) oder Chalkon-α,β-epoxid (46), 10 μM RslO5 und 5 mM NADH in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) in einem Gesamtvolumen von 100 μL und 2 h bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion mit 46 wurde auch in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0) durchgeführt, der mit deuteriertem Wasser (2H2O) zubereitet und einer LC-HRESIMS-Analyse unterzogen wurde, um den 2H-Einbau in 47 aus dem Lösungsmittel zu untersuchen. Um 47 zur Strukturaufklärung zu isolieren, wurden 15-ml-Reaktionen in 50 mM PBS-Puffer (pH 7,0), der 100 μM 46, 10 μM RslO5 und 5 mM NADH enthielt, 6 Stunden lang bei 30 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde mit einem gleichen Volumen vorgekühltem Butanon gestoppt. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 2057 × g und 4 ° C wurden die Überstände dreimal mit einem gleichen Volumen vorgekühltem Butanon extrahiert. Das Butanon wurde unter Vakuum auf einem Eisbad entfernt. Die Rohextrakte wurden in 500 μl MeOH gelöst und durch semipräparative HPLC unter Verwendung einer C18-Säule (250 mm × 10,0 mm, 5 μm; Phenomenex, USA) mit einem isokratischen Elutionsgradienten von 60 % A (H2O mit 0,8) gereinigt % Ameisensäure)/40 % B (MeCN) bei einer Flussrate von 2,5 ml min−1, um 47 (3,0 mg, 41,0 %) zu ergeben.

Die Reinigung der D-Glucose-Dehydrogenasen BmGDH aus Bacillus megaterium DSM 2894 in E. coli BL21(DE3)/pRSF-BmGDH und TaGDH aus Thermoplasma acidophilum in E. coli BL21(DE3)/pCSG3622 wurde gemäß unserer vorherigen Studie76 durchgeführt. Im Falle der RslO5/GDH-Kopplungstests wurde die Reduktion von NADP zu NADPH zunächst in einer 100-μL-Reaktion durchgeführt, die 10 μM TaGDH (oder BmGDH), 2 mM NADP und 100 mM [1-2H]d-Glucose in 50 mM enthielt Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) durch 1-stündige Inkubation bei 37 °C für BmGDH oder 50 °C für TaGDH, gefolgt von der Zugabe von 100 μM 46 und 10 mM RslO5 und weiterer 6-stündiger Inkubation bei 30 °C. Das in situ erzeugte 2H-markierte NADH wurde auch mit 1 und FAD umgesetzt, um den Einbau von 2H in das Produkt 7 zu überwachen. Die Reaktionen wurden mit einem gleichen Volumen eiskaltem MeOH gequencht und mittels LC-HRESIMS unter Verwendung der allgemeinen Analyse analysiert HPLC-Methode.

Gemischte Torsions-/Low-Mode-Konformationssuchen wurden mit der Software Macromodel 10.8.011 unter Verwendung des MMFF mit einem impliziten Lösungsmittelmodell für CHCl3 unter Anwendung eines Energiefensters von 21 kJ/mol77 durchgeführt. Geometrie-Neuoptimierungen der resultierenden Konformere wurden auf der ωB97X/TZVP-Ebene mit dem PCM-Lösungsmittelmodell für MeCN durchgeführt. TDDFT-ECD-Berechnungen wurden mit Gaussian 09 für ECD unter Verwendung verschiedener Funktionale (B3LYP, BH&HLYP, CAM-B3LYP, PBE0) und des TZVP-Basissatzes mit demselben Lösungsmittelmodell wie im vorherigen DFT-Optimierungsschritt78 durchgeführt. ECD-Spektren wurden als Summe von Gaußkurven mit Halbwertsbreiten von 3000 und 3600 cm-1 unter Verwendung von anhand der Dipolgeschwindigkeit berechneten Rotationsstärkewerten erzeugt79. Boltzmann-Verteilungen wurden aus den ωB97X-Energien geschätzt. Zur Visualisierung der Ergebnisse wurde das Softwarepaket MOLEKEL verwendet80.

Ein Einkristall von 7, 10 und 23 wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus MeOH und Wasser erhalten, und Einkristalle von 40 wurden in einem Lösungsmittelgemisch aus CH3CN und H2O erhalten. Die geeigneten Kristalle wurden ausgewählt und die Kristalldaten wurden auf einem XtaLAB AFC12 (RINC): Kappa-Einzeldiffraktometer mit Cu-Kα-Strahlung (λ = 1,541 84 Å) aufgezeichnet. Die Kristalle wurden während der Datenerfassung bei 99,9(7) K für 7, 99,8(9) K für 23, 100,00(10) K für 10 und 100,01(12) K für 40 gehalten. Unter Verwendung von Olex281 wurde die Struktur mit dem Strukturlösungsprogramm ShelXT82 unter Verwendung intrinsischer Phaseneinstellung gelöst und mit dem ShelXL-Verfeinerungspaket unter Verwendung der Minimierung der kleinsten Quadrate verfeinert.

Die Daten und der Code in diesem Manuskript wurden ordnungsgemäß in einem öffentlichen Datenrepository hinterlegt oder in den Zusatzinformationen zur öffentlichen Verfügbarkeit bereitgestellt. Kristallographische Daten können für 7 (CCDC 2036399), 10 (CCDC 2129081), 23 (CCDC 2036400) und 40 (CCDC 2036401) kostenlos über www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif oder von angefordert werden Senden Sie eine E-Mail an [email protected] oder wenden Sie sich an das Cambridge Crystallographic Data Centre, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK; Fax: +44 1223 336033. Die GenBank-Zugangsnummer für das DNA-Fragment von rslO5 lautet KJ437438.1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/KJ437438.1).

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Diese Arbeit wird teilweise von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (31820103003 an CZ, 42176127 an WZ, 41676165 an WZ, 31630004 an CZ und 31700042 an CY); Schlüsselprojekt für Wissenschaft und Technologie der Provinz Hainan (ZDKJ202018 an CZ); MOST (2018YFA0901903 bis YZ); KC Wong Education Foundation (GJTD-2020-12 an CZ); der Guangdong Provincial Special Fund for Marine Economic Development Project (GDNRC[2021] 48 an CZ); Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou) (GML2019ZD0406 bis CZ); CAS der Youth Innovation Promotion Association (2022349 bis CY) und das Wissenschafts- und Technologieplanungsprojekt von Guangzhou (202102020471 bis CY). BCD dankt dem PhD Fellowship des CAS-TWAS-Präsidenten für seine Unterstützung. H.-wL dankt der Welch Foundation (F-1511) für die Unterstützung. GB wird durch ein Sir Charles Hercus Fellowship des Health Research Council of New Zealand unterstützt. Wir bedanken uns bei Professor Keqiang Fan vom Institut für Mikrobiologie der Chinesischen Akademie der Wissenschaften für die großzügige Spende der Verbindung 30. Wir danken Professor Tadhg Begley von der Texas A&M University für die hilfreiche Diskussion. Wir danken Dr. ZH Xiao, XH Zheng, AJ Sun, Y. Zhang und X. Ma im Equipment Public Service Center am SCSIO für die Aufzeichnung spektroskopischer Daten. Wir danken auch der Unterstützung des Datenarchivs durch das National Earth System Data Center, National Science & Technology Infrastructure of China (http://www.geodata.cn).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang.

Schlüssellabor für tropische marine Bioressourcen und Ökologie, Guangdong Schlüssellabor für Marine Materia Medica, Südchinesisches Meeresinstitut für Ozeanologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Guangzhou, 510301, China

Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Chunshuai Huang, Liping Zhang, Wei Liu, Yiguang Zhu und Changsheng Zhang

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, 19 Yuquan Road, Peking, 100049, China

Bidhan Chandra De, Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Liping Zhang, Yiguang Zhu und Changsheng Zhang

Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory (Guangzhou), 1119 Haibin Road, Nansha District, Guangzhou, 511458, China

Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Liping Zhang, Yiguang Zhu und Changsheng Zhang

Sanya Institute of Ocean Eco-Environmental Engineering, Yazhou Scientific Bay, Sanya, 572000, China

Wenjun Zhang, Chunfang Yang, Yiguang Zhu und Changsheng Zhang

Abteilung für Organische Chemie, Universität Debrecen, Postfach 400, H-4002, Debrecen, Ungarn

Attila Mándi & Tibor Kurtán

Abteilung für chemische Biologie und medizinische Chemie, College of Pharmacy und Department of Chemistry, University of Texas at Austin, Austin, TX, 78712, USA

Mark W. Ruszczycky & Hung-wen Liu

Staatliches Schlüssellabor für natürliche und biomimetische Arzneimittel, Fakultät für Pharmazeutische Wissenschaften, Universität Peking, 38 Xueyuan Road, Bezirk Haidian, Peking, 100191, China

Ming Ma

Labor für molekulare und mikrobielle Biochemie, School of Biological Sciences, The University of Auckland, Auckland, Neuseeland

Ghader Bashiri

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BCD, WZ, CY, HC, LP und WL führten Epoxidöffnungsreaktionen, Verbindungsisolierung und Strukturbestimmung durch. AM und TK führten die ECD-Berechnungen durch. MM und GB steuerten wichtige Verbindungen und Reagenzien bei. BCD, WZ, MWR, YZ, TK, HwL und CZ analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. CZ und HwL leiteten die Forschung. BCD und WZ haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Hung-wen Liu oder Changsheng Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Xudong Qu und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

De, BC, Zhang, W., Yang, C. et al. Durch Flavin ermöglichte reduktive und oxidative Ringöffnungsreaktionen von Epoxiden. Nat Commun 13, 4896 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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Eingegangen: 09. April 2022

Angenommen: 08. August 2022

Veröffentlicht: 20. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32641-1

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