Zwei Isoformen der Fettsäureamidhydrolase aus Hülsenfrüchten mit unterschiedlichen Präferenzen für Mikroben

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7486 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Fettsäureamidhydrolase (FAAH) ist eine in Eukaryoten weit verbreitete Amidase, die vielleicht am besten für die Inaktivierung von N-Acylethanolamin-Lipidmediatoren bekannt ist. FAAH-Enzyme hydrolysieren jedoch ein breites Spektrum an Acylamidsubstraten. Die Analyse von FAAHs aus mehreren Angiospermenarten ergab zwei konservierte phylogenetische Gruppen, die sich in wichtigen konservierten Resten in der Substratbindungstasche unterschieden. Während die Grundgruppe pflanzlicher FAAHs mit der Bezeichnung FAAH1 auf struktureller und funktioneller Ebene in Arabidopsis thaliana untersucht wurde, ist über FAAH2-Mitglieder nichts bekannt. Hier haben wir rechnerische und biochemische Ansätze kombiniert, um die strukturellen und enzymatischen Eigenschaften zweier FAAH-Isoformen in der Hülsenfrucht Medicago truncatula mit der Bezeichnung MtFAAH1 und MtFAAH2a zu vergleichen. Unterschiede in den strukturellen und physikalisch-chemischen Eigenschaften der Substratbindungstaschen, die anhand von Homologiemodellen, molekularem Docking und molekulardynamischen Simulationsexperimenten vorhergesagt wurden, ließen darauf schließen, dass diese beiden FAAH-Isoformen Unterschiede in ihren Amidohydrolase-Aktivitätsprofilen aufweisen würden. Tatsächlich zeigten kinetische Studien gereinigter, rekombinanter MtFAAHs eine gegenseitige Präferenz für Acylamidsubstrate, wobei MtFAAH1 langkettige Acylamide effizienter nutzte und MtFAAH2a kurzkettige und aromatische Acylamide effizienter hydrolysierte. Dieser erste Bericht über das enzymatische Verhalten zweier phylogenetisch unterschiedlicher pflanzlicher FAAHs wird eine Grundlage für weitere Untersuchungen zu FAAH-Isoformen in Hülsenfrüchten und anderen Pflanzenarten bilden.

Fettsäureamidhydrolase (FAAH) ist eine konservierte Amidase, die lipophile N-Acylethanolamine (NAEs) in Ethanolamin und freie Fettsäure hydrolysiert1,2,3,4. Zum Beispiel; Die FAAHs von Ratten, Mäusen und Menschen hydrolysieren endogenes Anandamid (NAE20:4) zu Arachidonsäure und Ethanolamin5,6. Bei Säugetieren ist dieser Prozess mit einer Vielzahl neurologischer und physiologischer Prozesse verbunden, die von der Schmerzwahrnehmung bis zur Ernährungsregulierung reichen7,8. In einem anderen Beispiel war das aus dem Pflanzenmoos Physcomitrella patens gewonnene rekombinante FAAH ebenfalls in der Lage, NAE20:4 in entsprechende Produkte zu hydrolysieren, was offenbar mit dem Wachstum und der Entwicklung der Moosart verbunden war9. An anderer Stelle wurde gezeigt, dass C. elegans ein FAAH-Enzym besitzt, das NAE20:4 metabolisiert und so die Regulierung der Langlebigkeit unterstützt10. Diese und zahlreiche andere Berichte haben eine weitgehend konservierte FAAH-Maschinerie über mehrere Arten hinweg für die NAE-Regulation in verschiedenen biologischen Prozessen gezeigt.

In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zeigten In-vitro- und In-vivo-Studien, dass A. thaliana FAAH (AtFAAH) die Amidbindung endogener NAEs, einschließlich gesättigter (z. B. NAE12:0), einfach gesättigter (z. B. NAE18:1) und NAEs, spalten kann mehrfach ungesättigte (z. B. NAE18:3) Spezies sowie von 9-LOX abgeleitete NAE-Oxylipine (9-Hydroxy-Linoleoylethanolamid; NAE-9-HOD)1,11,12,13. Die Regulierung des NAE-Gehalts durch FAAH scheint mit einer Vielzahl biologischer Prozesse verbunden zu sein14. Bei Arabidopsis beispielsweise wiesen AtFAAH-überexprimierende Linien im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen geringere Mengen an endogenen NAEs auf und zeigten größere Unterschiede im Keimlingswachstum15, der Blütezeit16 und der angeborenen Immunität17. Im Gegensatz dazu hatten Arabidopsis faah-knockouts einen erhöhten endogenen NAE-Gehalt und reagierten überempfindlich auf Wachstumshemmung, die durch externe Anwendungen mit NAEs (z. B. NAE12:0 oder NAE18:2)15,18,19, Alkamiden20,21 und N-Acylhomoserinlactonen hervorgerufen wurde (AHLs)22 oder das Phytohormon ABA13. In einem anderen Bericht zeigten Hochlandbaumwollsämlinge (Gossypium hirsutum L.) mit ektopischer Überexpression von AtFAAH Unempfindlichkeit gegenüber NAE12:0 oder dem von NAE18:2 abgeleiteten Hydroxid (NAE-9-HOD) und ähnelten somit den Ergebnissen, die bei Arabidopsis gefunden wurden23. Diese Berichte legen nahe, dass die Regulierung des N-Acylethanolamid-Gehalts durch FAAH eine Reihe physiologischer Prozesse in Pflanzen beeinflussen kann.

N-Acyl-ʟ-Homoserinlactone (AHLs) oder N-Aryl-ʟ-Homoserinlactone (Aryl-HLs) sind von Bakterien stammende Lipide, die in Zell-zu-Zell-Kommunikationsprozessen (Quorum Sensing; QS) (z. B. Biofilm) verwendet werden Produktion) oder Interaktionen mit einem Wirt (z. B. Erkennung symbiotischer oder pathogener Bakterien)24,25,26. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen NAEs und diesen QS-Molekülen (polare Kopfgruppe mit einem amidgebundenen Acylschwanz) wurde die Hypothese aufgestellt, dass pflanzliche FAAHs AHLs und Aryl-HLs hydrolysieren könnten22. Weitere Experimente ergaben, dass rekombinantes AtFAAH lange Acylketten-AHLs wie OdDHL (N-(3-Oxododecanoyl)-ʟ-Homoserinlacton) oder OtDHL (N-(3-Oxotetradecanoyl)-ʟ-Homoserinlacton) besser hydrolysiert als AHLs mit kürzeren Ketten wie OHHL (N-(3-Oxohexanoyl)-ʟ-homoserinlacton)22, was darauf hinweist, dass die AtFAAH-Aktivität durch die Länge/Art der Acylkette im Substrat beeinflusst werden kann. Im gleichen Experiment war das Aryl-HL, p-Cumaryl-HL ein schlechtes Substrat für AtFAAH22. Außerdem wurde gezeigt, dass AHLs eine „biphasische“ Wachstumsreaktion bei A. thaliana-Sämlingen auslösen. In ihren Experimenten zeigten mit AHLs gefütterte Wildtyp-Arabidopsis-Sämlinge verstärkte oder verringerte Wachstumsphänotypen bei niedrigen (z. B. 0,1 µM) bzw. erhöhten AHL-Konzentrationen (z. B. 100 µM)22. Anschließend ergaben direkte Vergleiche mit Arabidopsis-Faah-Knockouts, dass diese Empfindlichkeit in FAAH-abhängiger Weise moduliert werden kann, d. h. für die Modulation des Wachstumssignals war eine Hydrolyse von AHLs durch FAAH erforderlich22.

Alkamide sind Fettsäureamide pilzlichen oder pflanzlichen Ursprungs21,27,28 und stellen eine weitere Gruppe NAE-ähnlicher Moleküle dar, die mit der FAAH-vermittelten Hydrolyse in Verbindung gebracht werden20. Bei Wildtyp-Arabidopsis führten exogene Anwendungen des Alkamids Affinin (N-Isobutyl-Kopfgruppe und Acylkette) zu einem „biphasischen“ Effekt, der dem von AHLs ähnelte (siehe oben). Tatsächlich hatten Arabidopsis-Wildtyp-Sämlinge, die mit Affinin in Konzentrationen unter 28 µM gefüttert wurden, Primärwurzeln, die länger waren als die Kontrollen21. Umgekehrt führte Affinin bei Konzentrationen über 28 µM zu einer deutlich beeinträchtigten Wurzelentwicklung21. In einer anderen Studie zeigten Arabidopsis-FAAH-Überexpressoren oder Faah-Knockouts, dass die Alkamid-Empfindlichkeit durch FAAH-Hydrolyse moduliert wurde20. Interessanterweise war die In-vitro-AtFAAH-Aktivität gegenüber Affinin oder anderen 12 Alkamiden mit unterschiedlichen Acylkettenlängen und Alkylkopfgruppen weitaus geringer als bei der AtFAAH-Hydrolyse von NAEs20. Dennoch belegen diese Berichte einen Zusammenhang zwischen der FAAH-Hydrolyse von Alkamiden und Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum.

FAAH ist durch das Vorhandensein einer konservierten katalytischen Ser-Ser-Lys-Triade gekennzeichnet1,29,30. Die N-Acylamide, die das aktive Zentrum am Acylbindungskanal (ABC) erreichen, bilden ein kovalentes Zwischenprodukt zwischen dem Substrat und dem Enzym. Dies wird durch die Aktivierung des katalytischen Serins (Nukleophil) erreicht, das den Kohlenstoff der Carbonylgruppe im Substrat angreift31. FAAHs von Säugetieren und Pflanzen schienen unterschiedliche Mechanismen für die Substratbindung zu haben. Beispielsweise wird angenommen, dass AtFAAH Konformationsänderungen durchläuft, die zur Bewegung einer Helixregion (Reste 531–537) und zum Verschluss seines Membranzugangskanals (MAC) führen, durch einen Prozess, der als „Squeeze and Lock“1 bezeichnet wird. Im Gegensatz dazu wird beim Ratten-FAAH der Ligand-Enzym-Komplex durch ein „dynamisches Paddel“ gesichert, das seinen engeren MAC schließt und das Substrat im aktiven Zentrum „einschließt“. In beiden Fällen wird Ethanolamin nach der FAAH-Katalyse über den zytosolischen Zugangskanal (CAC) in das Zytosol freigesetzt, während das Fettsäureprodukt zurück in die hydrophobe Umgebung der Membrandoppelschicht freigesetzt wird1,29. Die aufgelösten Kristallstrukturen sowohl von pflanzlichen als auch von Säugetier-FAAHs haben Einblicke in wichtige strukturelle und funktionelle Komponenten geliefert, die als Referenz für FAAHs anderer Organismen verwendet werden könnten.

Kürzlich ergab der Vergleich von 88 FAAH-Aminosäuresequenzen verschiedener Angiospermenarten zwei große phylogenetische Gruppen, FAAH1 und FAAH232. Pflanzenarten der Brassica-Familie wie A. thaliana oder Camelina sativa wiesen nur eine FAAH-Isoform (FAAH1) auf, wohingegen alle zweikeimblättrigen und einkeimblättrigen Arten, einschließlich Amborella trichopoda (die „Angiospermen-Urart“), beide FAAH-Gruppen hatten und viele mehr als ein Mitglied32. Beispielsweise weist die Tomate (Solanum tuberosum) drei FAAH1-Isoformen und eine FAAH2 auf, wohingegen Reis (Oryza sativa) eine FAAH1- und zwei FAAH2-Isoformen aufweist32. Die Analyse mehrerer Sequenzalignments zeigte Restveränderungen in Regionen, die der Substratbindungstasche der FAAH1- und FAAH2-Isoformen entsprechen. Die Homologiemodellierung von Sojabohnen-FAAHs (Glycine max) ergab zusätzliche strukturelle und chemische Unterschiede zwischen den Sojabohnen-FAAH1 und FAAH232. Es wurde angenommen, dass diese Unterschiede die Substratselektivität der FAAH1- und FAAH2-Enzyme beeinflussen, und legen außerdem nahe, dass FAAHs möglicherweise unterschiedliche FAAH-Maschinen entwickelt haben, um ein erweitertes Repertoire lipophiler Signallipide zu modulieren32,33. Obwohl diese Annahme konzeptionell plausibel erscheint, fehlen bisher experimentelle Beweise zur Stützung dieser Hypothese, vor allem weil keine biochemischen Informationen zur FAAH2-Enzymgruppe vorliegen. Hier schließen wir diese Wissenslücke, indem wir rechnerische und biochemische Ansätze kombinieren, um zwei FAAHs aus der Hülsenfrucht Medicago truncatula, MtFAAH1 und MtFAAH2a, zu untersuchen und zu charakterisieren, und liefern Beweise dafür, dass diese beiden Isoformen reziproke Substratpräferenzen haben.

Um die FAAH-Diversität innerhalb von Hülsenfrüchten zu untersuchen, verglichen wir FAAH-Aminosäuresequenzen von zehn ausgewählten Arten unter Verwendung von AtFAAH (einem FAAH1-Enzym) als Referenz (Abb. 1a; Ergänzungstabelle S1). Die Daten zeigten, dass sich diese Hülsenfrucht-FAAHs in zwei Hauptgruppen gruppierten, die als FAAH1 und FAAH2 bezeichnet werden (Abb. 1a). In jeder Hülsenfruchtart wurde nur eine FAAH1-Isoform identifiziert. Bemerkenswerterweise bildete FAAH2 bei den meisten Arten zwei Untergruppen, FAAH2a und FAAH2b. Mit Ausnahme von G. max und Vigna radiata hatten die übrigen Hülsenfrüchte (einschließlich M. truncatula) zwei FAAH2-Isoformen. Im Vergleich zum Gründungsmitglied von FAAH1, AtFAAH, betrugen die Prozentsätze der Aminosäuresequenzähnlichkeit für MtFAAH1, MtFAAH2a oder MtFAAH2b ungefähr 66 %, 44 % bzw. 44 % (Ergänzungsabbildung S1; Ergänzungstabelle S2).

Analyse von Sequenzen und Homologiemodellen von Medicago truncatula FAAHs, nämlich MtFAAH1 und MtFAAH2a. (a) Phylogenetische Analyse der Aminosäuresequenzen von FAAHs aus 10 verschiedenen Hülsenfruchtarten. Als FAAH1-Kontrolle wurde auch die FAAH-Sequenz (AtFAAH) von A. thaliana in die Analyse einbezogen. Sternchen kennzeichnen die MtFAAH-Sequenzen, die in dieser Studie weiter untersucht wurden. (b) Homologiemodelle von MtFAAH1 und MtFAAH2a (oberes Feld). Membranzugangskanal (MAC) und Membranbindungskappe (MBC) sind in den Strukturen markiert. Zu Visualisierungszwecken ist eine 90°-Ansicht derselben Modelle enthalten (unteres Feld). Die Amidase-Signaturdomäne (AS) von AtFAAH (lila) wurde mit der (c) AS von MtFAAH1 (grün) oder (d) der AS von MtFAAH2a (gelb) überlagert. Für (c) und (d) wird eine Nahaufnahme ihrer katalytischen Triadenreste dargestellt.

Die Untersuchung der Transkript-Expressionsprofile von MtFAAH1, MtFAAH2a und MtFAAH2b im Genexpressionsatlas „MtExpress“ von Medicago truncatula34 zeigte, dass MtFAAH1 oder MtFAAH2a in verschiedenen Geweben, Temperaturbedingungen, Zeitpunkten, abiotischen Belastungen (z. B. N-Mangel) usw. stark exprimiert wurden biotischer Stress (z. B. Exposition gegenüber dem arbuskulären Mykorrhizapilz Rhizophagus unregelmäßigis), während MtFAAH2b unter den gleichen Bedingungen in einem viel geringeren Ausmaß exprimiert wurde (ergänzende Abbildung S2). Basierend auf diesen Daten haben wir MtFAAH1 und MtFAAH2a für die weitere Analyse sowohl mit rechnerischen als auch mit biochemischen Ansätzen ausgewählt.

Homologiemodelle von MtFAAH1 und MtFAAH2a wurden basierend auf der Kristallstruktur von AtFAAH (PBD: 6DHV) zum Vergleich ihrer Strukturmerkmale vorhergesagt (Abb. 1b). Die Qualität der Modelle MtFAAH1 und MtFAAH2a wurde durch GMQE-Werte (Global Model Quality Estimate) (0,90 für MtFAAH1 und 0,80 für MtFAAH2a), QMEANDisCo-Werte (Qmean Consensus-based Distance Constraint) (0,88 für MtFAAH1 und 0,79 für MtFAAH2a) unterstützt Ramachandran-Scores (Ramachandran bevorzugt; 95,59 % für MtFAAH1 und 94,31 % für MtFAAH2a) (Ergänzende Abbildungen S3, S4; Ergänzende Tabelle S3, S4). Beide Modelle werden als Homodimere dargestellt (Abb. 1b) mit ähnlichem vorhergesagten Gesamtinhalt und ähnlicher Organisation von Alpha-Helices, Beta-Faltblättern, Windungen und unstrukturierten Spulen (ergänzende Abb. S5). Sowohl MtFAAH1 als auch MtFAAH2a weisen an ihren N-Termini konservierte Membranbindungskappen (MBCs) und Membranzugangskanäle (MACs) auf (Abb. 1b, ergänzende Abb. S6), von denen vorhergesagt wird, dass sie FAAH an der Membran verankern . Wie in der AtFAAH-Kristallstruktur sind die MBCs beider MtFAAHs durch eine Prävalenz hydrophober Reste gekennzeichnet (ergänzende Abbildung S6). Wie erwartet ist die Amidase-Signaturdomäne (AS) von AtFAAH wie bei anderen Mitgliedern der FAAH-Familie durch das Vorhandensein einer katalytischen Ser-Ser-Lys-Triade gekennzeichnet, und diese Reste sind hier in MtFAAH1 und MtFAAH2a konserviert (Abb. 1c, d). . Insgesamt unterstreichen diese Daten die Erhaltung der vorhergesagten Membranassoziation und der Reste des aktiven Zentrums für MtFAAH1 und MtFAAH2a.

Zuvor wurden in einem Bericht mehrere wichtige Restunterschiede hervorgehoben, die die vorhergesagte Form und Eigenschaften der Substratbindungstaschen (SBPs) der Sojabohnen FAAH1 und FAAH232 veränderten. Um zu bestätigen, dass solche Ergebnisse in einer anderen Hülsenfruchtart erhalten bleiben, haben wir die SBPs der FAAHs von M. truncatula, MtFAAH1 und MtFAAH2a, analysiert. Die Daten zeigten mehrere Restunterschiede, insbesondere innerhalb der Kanäle für den zytosolischen Zugang (CAC) und die Acylbindung (ABC) (Abb. 2; Ergänzungstabelle S5). Der CAC von MtFAAH1 hat mehrere polare (z. B. Thr299, Glu337), während diese Reste im CAC von MtFAAH2a unpolare Aminosäuren sind (z. B. Val306, Trp341) (Abb. 2a – e). Darüber hinaus hat MtFAAH1 den weniger sperrigen Rest Gly334 in seinem CAC positioniert. Dies schien im Vergleich zu seinem FAAH2-Gegenstück einen offeneren Hohlraum zu bieten (Abb. 2a – e). Umgekehrt enthält MtFAAH2a den großen aromatischen Rest Trp341 in seinem CAC, was zu einem restriktiveren CAC führt (Abb. 2a – e). Das ABC von MtFAAH1 ist durch unpolare/hydrophobe Reste wie Leu441, Phe475, Met531 gekennzeichnet, während diese Reste in MtFAAH2a durch drei Tyrosinreste (Tyr444, Tyr477 und Tyr533) ersetzt wurden, die für neutralere, polarere und aromatischere Umgebungen sorgen (Abb. 2a–e). Darüber hinaus führten die Tyrosinreste in MtFAAH2a zu einem geschlosseneren, kürzeren ABC (Abb. 2a – e). Im Gegensatz dazu ergaben die Reste in MtFAAH1 ein offeneres ABC, wie in ihren aromatischen und hydrophoben Oberflächenprofilen (Abb. 2d, e) gezeigt wird, die dem ACB von AtFAAH11 ähnlicher sind. Bemerkenswerterweise sind mehrere der in den SBPs von MtFAAH1 oder MtFAAH2 gefundenen Reste in den FAAH1- oder FAAH2-Gruppen mehrerer Hülsenfruchtarten konserviert (ergänzende Abbildung S7). Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass MtFAAH1 und MtFAAH2a in ihren SBPs unterschiedliche strukturelle und physiochemische Eigenschaften aufweisen. Daher ist es wahrscheinlich, dass diese unterschiedlichen SBPs unterschiedliche Acylamidstrukturen aufnehmen.

Substratbindungstaschen (SBPs) von MtFAAH1 und MtFAAH2a weisen unterschiedliche strukturelle und physikalisch-chemische Profile auf. Es werden Rückstände angezeigt, von denen vorhergesagt wird, dass sie in den SBPs von (a) MtFAAH1 (Cyan-Farbstifte) oder (b) MtFAAH2a (Orange-Farbstifte) unterschiedlich sind. Die vollständige Liste der Reste, von denen angenommen wird, dass sie die SBPs beider MtFAAHs bilden, finden Sie in der Ergänzungstabelle S3. (c) Teilweise Ausrichtung zwischen MtFAAH1- und MtFAAH2a-Aminosäuresequenzen. Pfeile, die auf Reste in Cyan- oder Orange-Schriftarten zeigen, repräsentieren unterschiedliche Reste im SBP von MtFAAH1 bzw. MtFAAH2a. (d) Aromatische Oberflächen für die in (a), (b) und (c) hervorgehobenen Reste zeigen unterschiedliche aromatische Profile. Die aromatische Skala beschreibt die Konformationen von Resten mit einer aromatischen Seitenkette von der Kante (blau) zur Fläche (orange). (e) Hydrophobizitätsoberflächenprofile für die in (a), (b) und (c) hervorgehobenen Reste. Die Hydrophobie-Skala reicht von 3,00 für den höchsten (braun) bis –3,00 für den niedrigsten (blau) hydrophoben Bereich.

Um zu testen, wie die Unterschiede in den SBPs von MtFAAH1 und MtFAAH2a die Substratbindung und -akkommodation verändern können, führten wir molekulare Docking-Experimente durch (Abb. 3). Um sowohl MtFAAH1 als auch MtFAAH2a vor den Docking-Experimenten geometrisch zu stabilisieren, führten wir 100 ns lang molekulardynamische Simulationen (MDS) der Apo-Formen von MtFAAH1 und MtFAAH2a durch. Die resultierenden MD-Trajektorien wurden mittels Root-Mean-Square-Deviation (RMSD) und Root-Mean-Square-Fluctuation (RMSF)-Berechnungen untersucht. Beide MtFAAHs schienen während der gesamten Simulation stabil zu sein, mit RMSD-Werten von etwa 1,5–1,7 Å für MtFAAH1 und 1,8–2,2 Å für MtFAAH2a (ergänzende Abbildung S8). Die RMSF-Werte zeigten ähnliche Fluktuationsprofile für beide MtFAAHs, mit Ausnahme einer Sequenzregion in MtFAAH2a, die aus den Resten 366–387 bestand, wo im Vergleich zu MtFAAH1 eine höhere Fluktuation beobachtet wurde (ergänzende Abbildung S8).

Molekulares Andocken der Untereinheit A von MtFAAH1 oder MtFAAH2a an verschiedene N-Acylamide. Die 2D-Strukturen von acht potenziellen Liganden für MtFAAHs wurden mit der Software ChemDraw (Molecular Editor) gezeichnet (a). Von den acht Ligandenkandidaten haben wir drei für Docking-Experimente ausgewählt, nämlich NAE18:2, NAE12:0 und p-Cumaryl-HL. Apo MtFAAH1 und MtFAAH2a wurden vor allen Docking-Experimenten molekulardynamischen Simulationen (MDS) (während 100 ns) unterzogen. Breitere und Nahaufnahmen von NAE18:2 (b, c), NAE12:0 (d, e) oder p-Cumaryl-HL (f, g), angedockt in MtFAAH1 oder MtFAAH2a. Kovalente Bindungen werden als Cyan-Linien zwischen den Seitenkettensauerstoffatomen der katalytischen Reste von MtFAAH1 (Ser304) oder MtFAAH2a (Ser311) und dem Kohlenstoff der Carbonylgruppe in den Substraten dargestellt. Wasserstoffbrückenbindungen werden als blaue Linien dargestellt, während hydrophobe (Van-der-Waals-)Wechselwirkungen als grau-gestrichelte Linien zwischen den interagierenden Atomen dargestellt werden. Die in den Bindungen angezeigten Zahlen geben Abstände (Å) zwischen den Kontaktpunkten an. Abkürzungen: Substratbindungstasche (SBP).

Für Docking-Studien wurden drei strukturell unterschiedliche Acylamide (Abb. 3a) verglichen – NAE18:2, NAE12:0 oder p-Cumaryl-HL. Die MD-stabilisierten MtFAAH1- oder MtFAAH2a-Homologiemodelle wurden mit diesen drei Liganden angedockt (Abb. 3b – g). Das Andocken offenbarte das Potenzial für kovalente Bindungen zwischen dem Seitenkettensauerstoff (Oγ) von Ser304 oder Ser311 und dem Kohlenstoff der Carbonylgruppe der Substrate mit Bindungsabständen im Bereich von 2,1 bis 2,6 Å. Die polaren Ethanolamin-Kopfgruppen von NAEs (NAE18:2 oder NAE12:0) wurden durch mehrere Wasserstoffbrücken in den SBPs von MtFAAH1 (Abb. 3b, d) und MtFAAH2a (Abb. 3c, e) gestützt; Dabei handelt es sich um Reste wie Gly301, Gly254, Thr299 und Asp206 in MtFAAH1 und Reste wie Gly308 und Gly309 in MtFAAH2a. Die Untersuchung von an p-Cumaryl-HL gebundenen MtFAAHs ergab einige interessante Ähnlichkeiten und Unterschiede. Sowohl MtFAAH1 als auch MtFAAH2a benötigten Glycinreste (Gly301 für MtFAAH1 und Gly308 für MtFAAH2a) für die Wasserstoffbindung mit der Kopfgruppe von p-Cumaryl-HL (Abb. 3f, g). Allerdings wurde die Homoserinlacton (HL)-Kopfgruppe von p-Cumaryl-HL im SBP von MtFAAH2a durch zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen, die durch Glu213, Met345 und Val306 vermittelt wurden, weitaus stärker unterstützt. Darüber hinaus positionierte MtFAAH1 Thr299 für Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen mit p-Cumaryl -HL-Kopfgruppe, während MtFAAH2a die aromatische Seitenkette von Trp341 und die Pyrrolidinschleife von Pro338 für hydrophobe Wechselwirkungen mit dem HL-Kopf aufwies (Abb. 3f, g). Diese Daten deuten auf eine ähnliche Organisation der katalytischen Triadenreste hin, um die Katalyse zu erreichen, und legen nahe, dass ähnliche und unterschiedliche Wechselwirkungen die verschiedenen polaren „Kopfregionen“ der Substrate in den aktiven Zentren von MtFAAHs stabilisieren.

Die Analyse der Wechselwirkungen zwischen den Acylketten von NAEs oder p-Cumaryl-HL und den Resten der SBPs von MtFAAHs ergab gewisse Ähnlichkeiten und Unterschiede. Die Acylkette von NAE18:2 wird in MtFAAH1 durch hydrophobe Wechselwirkungen mit Leu441 und einer Reihe von drei Threoninresten (Thr257, Thr258, Thr529) unterstützt. Die geometrische Positionierung dieser Reste in MtFAAH1 scheint eine flexible Umgebung für die Unterbringung langer Acylketten zu bieten (Abb. 3b; ergänzende Abb. S9), ähnlich der für AtFAAH11 berichteten. Die Bindung von NAE18:2 in MtFAAH2a wurde durch vorhergesagte hydrophobe Wechselwirkungen mit Thr264, Ile447, Ile540 und zwei Tyrosinresten, Tyr533 und Tyr444, unterstützt (Abb. 3c). Im Vergleich zu MtFAAH1 schien die Oberfläche der MtFAAH2a-Bindungstasche anders geformt zu sein, um NAE18:2 aufzunehmen (Abb. 3c; ergänzende Abb. S9). Es scheint, dass die Acylkette von NAE18:2 in MtFAAH2a strukturell stärker komprimiert sein könnte, vermutlich um sich an ein SBP mit restriktiverer Größe in MtFAAH2a anzupassen (Abb. 3c; ergänzende Abb. S9). Die Acylkette des kürzeren NAE (NAE12:0), das in MtFAAH1 oder MtFAAH2a angedockt ist, wird in beiden Fällen durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen mit der aliphatischen Aminosäure Isoleucin (Ile444 für MtFAAH1 oder Ile540 für MtFAAH2a) unterstützt (Abb. 3d, e). Darüber hinaus hat MtFAAH2a den aromatischen Rest Tyrosin (Tyr533) für Wechselwirkungen an den Positionen C11 und C12 des NAE12:0-Schwanzes positioniert, während MtFAAH1 Leu441 für Wechselwirkungen an C10 der Acylkette von NAE anzeigt (Abb. 3d, e). Im Gegensatz zu MtFAAH1 scheint MtFAAH2a eine aromatischere Oberfläche zu besitzen, um NAE12:0 in sein SBP aufzunehmen (Abb. 3d, e; ergänzende Abb. S9). Schließlich nimmt MtFAAH1 p-Cumaryl-HL durch vorhergesagte Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen Thr257 und dem aromatischen Schwanz des Aryl-HL auf (Abb. 3f), während MtFAAH2a neben den Wechselwirkungen mit ähnlichen Resten (Ile447) auch einen aromatischen Rest positioniert hat , Tyr477, für zusätzliche Wasserstoffbrückenbindungen und π-π-Wechselwirkungen mit der phenolischen Acyleinheit von p-Cumaryl-HL (Abb. 3g; ergänzende Abb. S9). Diese Daten legen nahe, dass MtFAAH1 oder MtFAAH2a NAEs oder Aryl-HLs über Reste mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften aufnehmen können. Tatsächlich scheint MtFAAH1 im Allgemeinen hydrophobe Reste mit aliphatischen Seitenketten zu verwenden, während MtFAAH2a durchweg neutrale Reste mit aromatischen Seitenketten verwendet.

Um zusätzliche Reste und Mechanismen, die möglicherweise an der Unterbringung von Substraten in MtFAAHs beteiligt sein könnten, weiter zu analysieren, führten wir 100 ns lang eine molekulardynamische Simulation (MDS) an MtFAAH1 oder MtFAAH2a durch, die an NAE18:2 oder p-Cumaryl-HL angedockt waren (Abb. 4, 5; Ergänzende Abbildungen S10, S11; Ergänzende Tabelle S6; Ergänzende Videos 1–12). Die MDS-Trajektorien für MtFAAH1 und MtFAAH2a zeigten, dass NAE18:2 oder p-Cumaryl-HL durch unterschiedliche vorhergesagte Wechselwirkungen angepasst werden können.

Molekulardynamiksimulationen (MDS) der Untereinheit A von MtFAAH1, gebunden an NAE18:2 (a, c) oder p-Cumaryl-HL (b, d). „0 ns“ entspricht den äquilibrierten Komplexen (orange), „10 ns“ und „100 ns“ stellen MDS-verarbeitete Komplexe bei 10 (lila) und 100 ns (grün) dar. Breitere und Nahaufnahmen von Helices-Regionen (Reste 530–536), dargestellt als übereinanderliegende Cartoons und Stäbchen, Substratbindungstasche (SBP) mit Liganden (Kugeln) und überlagerten Resten (Stäbchen), ausgewählt aus Docking-Experimenten, und vorhergesagte α1- und α2-Helices werden als überlappende Cartoons und Stöcke angezeigt (a, b). Die in den Van-der-Waals-Bindungen angezeigten Zahlen (gelb gestrichelte Linien) stellen Abstände (Å) zwischen den Kontaktpunkten dar. Nahaufnahme der Oberfläche des Membranzugangskanals (MAC) von MtFAAH1, gebunden an NAE18:2 (c) oder p-Cumaryl-HL (d).

Molekulardynamiksimulationen (MDS) der Untereinheit A von MtFAAH2a, gebunden an NAE18:2 (a, c) oder p-Cumaryl-HL (b, d). „0 ns“ entspricht den äquilibrierten Komplexen (gelb), „10 ns“ und „100 ns“ stellen MDS-verarbeitete Komplexe bei 10 (blau) und 100 ns (cyan) dar. Breitere und Nahaufnahmen von Helices-Regionen (Reste 530–536), dargestellt als übereinanderliegende Cartoons und Stäbchen, Substratbindungstasche (SBP) mit Ligand (Kugeln) und überlagerten Resten (Stäbchen), ausgewählt aus Docking-Experimenten, und vorhergesagte α1- und α2-Helices werden als überlappende Cartoons und Stöcke angezeigt (a, b). Die in den Van-der-Waals-Bindungen angezeigten Zahlen (gelb gestrichelte Linien) stellen Abstände (Å) zwischen den Kontaktpunkten dar. Nahaufnahme der Oberfläche des Membranzugangskanals (MAC) von MtFAAH1, gebunden an NAE18:2 (c) oder p-Cumaryl-HL (d).

Im SBP von MtFAAH1 scheint NAE18:2 die Unterbringung seiner Acylkette über Thr534 und Met531 zu erfordern (Abb. 4a; Ergänzungstabelle S6, Ergänzungsvideo S1, S2). Diese Reste befinden sich innerhalb einer Helixregion (Reste 530 bis 536), von der bekannt ist, dass sie für den „Squeeze“- und „Lock“-Mechanismus notwendig ist, wie an anderer Stelle für AtFAAH berichtet1. Bei 10 und 100 ns wurden Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen Thr534 und mehreren Kohlenstoffatomen der Acylkette von NAE18:2 beobachtet, nämlich C14 bis C16 bzw. C12–C13. Darüber hinaus scheint der Rest Met531, der sich am Ende der Helixregion befindet, sehr flexibel zu sein und könnte möglicherweise ähnliche Wechselwirkungen mit NAE18:2 an der C10-Position eingehen, wie bei 100 ns gezeigt (Abb. 4a). Eine genaue Untersuchung am SBP ergab, dass sich die Konformation des Acylschwanzes von NAE18:2 im Laufe der Zeit veränderte. Tatsächlich war der NAE18:2-Schwanz während der Simulation sehr flexibel, insbesondere von C12 bis C18, und orientierte sich von C1 bis C9 in einer geraden Linie bei 100 ns (Abb. 4a; Zusatzvideo S1, S2). Dies deutet auf ein hochflexibles SBP hin, das für die Aufnahme von Acylamiden mit langen Acylketten geeignet ist. Darüber hinaus ergab die Analyse des MAC eine Einwärtsbewegung der α1-Helix (Reste 51–58). Diese Bewegung scheint zum Schließen des MAC nach der Bindung an NAE18:2 zu führen (Abb. 4c), was auf einen „Lock“-Mechanismus hindeuten könnte, um das Substrat für die Katalyse in der Bindungstasche einzuschließen (Ergänzungsvideo S3). Im Gegensatz dazu deutete die Analyse von MtFAAH1, das an p-Cumaryl-HL gebunden ist, darauf hin, dass dieses Aryl-HL schlecht im SBP von MtFAAH1 untergebracht ist und nur wenige potenzielle Wechselwirkungen aufweist (Abb. 4b; Zusatzvideo S4, S5). Tatsächlich schien die Helixregion (Reste 530–536) überhaupt nicht mit dem p-Cumaryl-HL-Substrat zu interagieren. Darüber hinaus waren Reste wie Met531 und Thr534 weit entfernt, um mit dem aromatischen Schwanz von p-Cumaryl-HL zu interagieren (Ergänzungsvideo S5), was darauf hindeutet, dass Protein-Ligand-Wechselwirkungen in dieser Region des SPB für p-Cumaryl höchst unwahrscheinlich sind -HL. Schließlich wurden weder in der Konformation der p-Cumaryl-HL-Struktur noch in der Bewegung der α1-Helix von MtFAAH1 MAC dramatische Veränderungen beobachtet, was im Verlauf der Simulation zu einem geöffneten oder teilweise geöffneten MAC führte (Abb. 4b, d; Ergänzungsvideo S6).

Anders als im Fall von MtFAAH1 zeigte die Helixregion (Reste 532–538) von MtFAAH2a bei der Bindung keine dramatische Bewegung in Richtung NAE18:2-Substrat (Abb. 5a; Ergänzungstabelle S6; Ergänzungsvideo S7, S8). Dennoch wurden Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen Tyr533 und der Acylkette von NAE18:2 an den Positionen C13 und C16 (10 ns) sowie an den Positionen C11 und C12 (100 ns) gefunden (Abb. 5a). Kein anderer Rest in dieser Region schien an der Acylkette von NAE18:2 beteiligt zu sein oder in engem Kontakt mit ihr zu stehen. Darüber hinaus schien die Konformation der Acylkette von NAE18:2 von C1 bis C9 im Verlauf der Simulation stark komprimiert zu sein und nur wenige Bewegungen aufzuweisen. Dieser Ligand zeigte am Ende der Simulation mehrere Verzerrungen an verschiedenen Kohlenstoffpositionen seines Schwanzes (Abb. 5a; Zusatzvideo S7, S8). Anders als der offenere SBP von MtFAAH1 schien die Anpassung von NAE18:2 an den kleineren SBP von MtFAAH2a viel eingeschränkter und restriktiver zu sein. Im Verlauf der Simulation wurde eine sehr leichte Auswärtsbewegung der α1-Helix (Reste 52–59) aufgezeichnet; Diese Bewegung fiel jedoch nicht mit dem Öffnen oder Schließen des MAC von MtFAAH2a MAC zusammen (Abb. 5c; Zusatzvideo S9). Die Bindung von MtFAAH2a an p-Cumaryl-HL wurde durch mehrere Wechselwirkungen unterstützt, einschließlich des Rests Tyr533 (Abb. 5b; Zusatzvideo S10, S11). Im Simulationszeitraum gab es konsistent enge Wechselwirkungen zwischen diesem Tyrosinrest und dem aromatischen Schwanz von p-Cumaryl-HL. Diese wahrscheinlichen π-π-Wechselwirkungen könnten diesen Liganden für die Katalyse fixieren (Abb. 5b; Zusatzvideo S11). Darüber hinaus haben wir auch konsistente hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Kopf-HL-Ring und dem Rest Trp341 festgestellt, der sich am zytosolischen Zugangskanal (CAC) des SBP von MtFAAH2a befindet (Abb. 5b; Zusatzvideo S10). Obwohl schließlich einige leichte Verschiebungen nach außen in der α1-Helix (Reste 52–59) des MAC von MtFAAH2a festgestellt wurden (Abb. 5b), wurden keine wesentlichen Änderungen festgestellt und der MAC blieb während der 100-ns-Simulation in einer geschlossenen Konformation (Abb . 5d; Ergänzungsvideo S12).

Insgesamt legen diese Daten unterschiedliche Möglichkeiten für den Einbau von Acylethanolamid-Substraten in die SBPs der Enzyme MtFAAH1 oder MtFAAH2a nahe. Unsere MDS-Experimente heben potenzielle Reste hervor, die an der bevorzugten Akkommodation von NAEs oder Aryl-HL-Substraten durch diese beiden Enzymisoformen beteiligt sein könnten.

Um die funktionellen Unterschiede zwischen MtFAAH1 und MtFAAH2 zu testen, haben wir MtFAAHs (Ergänzungsabbildung S12; Ergänzungstabelle S8) als His-markierte Fusionen zur Produktion rekombinanter Proteine ​​in E. coli in Expressionsvektoren kloniert. Um die rekombinanten Proteine ​​zu reinigen, verwendeten wir Techniken der Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall (Nickel) (IMAC) und Größenausschlusschromatographie (SEC) (Abb. 6). Wir beobachteten markante Banden bei ≈ 70 kDa, die MtFAAH1 und MtFAAH2a aus den IMAC-gereinigten und SEC-gereinigten Proben darstellen (Abb. 6b, d). Diese Banden entsprachen den berechneten Molekulargewichten (MW) der MtFAAHs-Proteine. Um zu beurteilen, ob sich die Oligomerisierungszustände jedes gereinigten MtFAAH von denen von AtFAAH1 unterscheiden, wurden die Elutionsvolumina aus den Chromatogrammen der Gelfiltrationsstandards und AtFAAH als Referenz für MtFAAH-Berechnungen verwendet (Abb. 6a; ergänzende Abb. S13). Wir beobachteten ein durchschnittliches Elutionsvolumen von 10,08 ml (bei pH 9,0) und 10,14 ml (bei pH 7,5) für MtFAAH1 bzw. MtFAAH2a (ergänzende Abbildung S13). In Lösung wurde das MW von MtFAAH1 auf ≈ 346 kDa und das von MtFAAH2a auf ≈ 371 kDa geschätzt (Abb. 6c, e; ergänzende Abb. S13). Unter Berücksichtigung der Molekulargewichte der einzelnen Untereinheiten von MtFAAH1 und MtFAAH2 von 69,6 bzw. 70,1 kDa (Abb. 6; ergänzende Abb. S13) und des angegebenen Molekulargewichts der DDM-Mizellen von ≈ 70 kDa35 schätzten wir, dass MtFAAH1 und MtFAAH2a jeweils gereinigt wurden als Tetramere (Ergänzende Abbildung S13). Die für Abb. 6b, d verwendeten unbeschnittenen/unbearbeiteten SDS-PAGE-Gele sind in den ergänzenden Abbildungen zu finden. S19 bzw. S20, während die Originalgele, die für die ergänzende Abbildung S13 verwendet wurden, in den ergänzenden Abbildungen zu finden sind. S21–S23.

Reinigung von Medicago truncatula FAAH1 und FAAH2a. (a) Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL-Chromatogramm der Gelfiltrationsstandards: Thyreoglobulin, 670 kDa; Apoferritin, 481 kDa; γ-Globulin, 158 kDa; Ovalbumin, 44 kDa; Myoglobin, 17 kDa; Vitamin B12, 1,35 kDa. (b) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von Fraktionen, die während der MtFAAH1-Reinigung entnommen wurden. Molekulargewichtsleiter (Spur M), Zelllysat von BL21 (DE3)-Zellen nach Ultraschallbehandlung (Spur 1), pelletierte Zelltrümmer nach Ultraschallbehandlung (Spur 2), Durchfluss durch die IMAC-Säule (Spur 3), IMAC-Elution (Spur 4), Größenausschlusschromatographie gereinigtes Protein (Spur 5). (c) Superdex 200-Erhöhung 10/300 GL-Chromatogramm der MtFAAH1-Reinigung. (d) Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel von Fraktionen, die während der MtFAAH2a-Reinigung entnommen wurden. Molekulargewichtsleiter (Spur M), Zelllysat von BL21 (DE3)-Zellen nach Ultraschallbehandlung (Spur 1), pelletierte Zelltrümmer nach Ultraschallbehandlung (Spur 2), Durchfluss durch eine Nickel-Affinitätssäule (Spur 3), gereinigtes Nickel-Affinitätsprotein (Spur 4), durch Größenausschlusschromatographie gereinigtes Protein (Spur 5). (e) Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL-Chromatogramm der MtFAAH2a-Reinigung. Pfeile und Klammern zeigen auf die SEC-gereinigten Fraktionen, die mittels SDS-PAGE analysiert und für Enzymaktivitätstests verwendet wurden. Die in (b) und (d) dargestellten unbeschnittenen/unbearbeiteten SDS-PAGE-Gele sind in den ergänzenden Abbildungen zu finden. S19 bzw. S20.

Zusätzlich verwendeten wir Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC/MS/MS), um die Identität der gereinigten rekombinanten MtFAAH- und AtFAAH-Proteine ​​zu bestätigen (Ergänzende Abbildungen S14, S15, S16). MtFAAH1, MtFAAH2a und AtFAAH hatten Abdeckungswerte von 77 % (43 einzigartige Peptide), 37 % (17 einzigartige Peptide) bzw. 100 % (243 einzigartige Peptide). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse die Produktion und Reinigung der Proteine ​​MtFAAH1 und MtFAAH2a und legen nahe, dass beide gereinigten MtFAAH-Proteinkomplexe größer als die AtFAAH-Dimere1 sind und wahrscheinlich als Homotetramere organisiert sind. Die unbeschnittenen/unbearbeiteten Gele, die für die ergänzenden Abbildungen verwendet wurden. S14–S16 finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. S24–S26.

Als erster Charakterisierungsschritt wurden die enzymatischen Aktivitäten von MtFAAH1 oder MtFAAH2a gegenüber NAE12:0 bei verschiedenen pH- oder Temperaturbedingungen gemessen (ergänzende Abbildung S17). SEC-gereinigte Proteine ​​wurden mit 100 µM NAE12:0 in Reaktionspuffern mit unterschiedlichen pH- (6,0, 7,0, 8,0 und 9,0) oder Temperaturbedingungen (20, 30, 40 und 50 °C) inkubiert. Ein flexibler, auf Fluorescamin basierender Assay wurde zum Nachweis von Reaktionsprodukten verwendet, wie an anderer Stelle berichtet22,36. Die Enzymaktivität wurde anhand einer Standardkurve für Ethanolamin als produziertes μmol Ethanolamin pro Minute und Milligramm Protein berechnet. Die MtFAAH1-Aktivität war bei pH 8,0 oder 9,0 am höchsten (ergänzende Abbildung S17), wohingegen MtFAAH2a bei pH 7,0 oder 8,0 maximal operierte (ergänzende Abbildung S17). Bemerkenswerterweise nahm die Aktivität von MtFAAH2a bei pH 9,0 dramatisch ab. Die Abhängigkeiten von gemäßigten Temperaturen waren für MtFAAH1 und MtFAAH2a ähnlich, wobei die Enzymaktivitäten bei Temperaturen zwischen 30 und 40 ° C optimal waren (ergänzende Abbildung S17). GC-MS bestätigte weiterhin die Umwandlung von NAE12:0 in das entsprechende freie Fettsäureprodukt (FFA) (ergänzende Abbildung S18) sowohl für MtFAAH-Enzyme als auch für die Positivkontrolle AtFAAH; gekochte („denaturierte“) Enzyme wurden als Negativkontrollen verwendet und zeigten keine Umwandlung von Substrat in Produkt. Die Identität des NAE12:0-Peaks wurde durch Retentionszeit und diagnostische Ionen bestätigt (ergänzende Abbildung S18), wie an anderer Stelle berichtet23. Die Identität von FFA 12:0 (Dodecansäure) wurde durch diagnostische Ionen (ergänzende Abbildung S18) und durch NIST-Bibliotheksvergleich (≈ 98 % Übereinstimmung) bestätigt. Bei den Reaktionen mit gekochtem MtFAAH1, MtFAAH2a oder AtFAAH erschienen in den Chromatogrammen nur die Peaks, die dem NAE12:0-Substrat entsprachen (ergänzende Abbildung S18).

Um den Fortschritt der MtFAAH1- oder MtFAAH2a-Reinigung zu bewerten, wurden Enzymaktivitäten in Zelllysaten, IMAC- und SEC-gereinigten Fraktionen in Richtung NAE12:0 (100 µM) gemessen (Ergänzungstabelle S7). Reinigungsgrade und Ausbeuten wurden im Verhältnis zu den Rohlysaten berechnet. Es wurde geschätzt, dass MtFAAH1 und MtFAAH2a gegenüber den Zellextrakten um das 1162-fache bzw. 3263-fache angereichert waren. Die SDS-Gelelektrophorese bestätigte die Reinheit jedes Proteins in den SEC-Fraktionen (Abb. 6; ergänzende Abb. S13).

Angesichts der wesentlichen Restunterschiede zwischen den SBPs von MtFAAH1 und MtFAAH2a und der Tatsache, dass Docking-Experimente auf eine unterschiedliche Akkommodation von N-Acyl-Substraten schließen lassen, stellten wir die Hypothese auf, dass solche Unterschiede zu unterschiedlichen Substratpräferenzen für MtFAAH1 und MtFAAH2a führen könnten. Steigende Konzentrationen von NAE12:0, NAE18:2, NAE-9-HOD, OdDHL, OtDHL, p-Cumaryl-HL, p-Cumaryltyramin und Affinin wurden mit gereinigtem MtFAAH1 oder MtFAAH2a 30 Minuten lang bei 30 °C inkubiert (Abb. 7). Für den Nachweis von Reaktionsprodukten wurden Fluorescamin-basierte Assays verwendet. Die Anfangsgeschwindigkeit (V) der Reaktionen wird als μmol produziertes Amin pro Minute und Milligramm Protein angegeben. Die aus Michaelis- und Menten-Diagrammen abgeleiteten Kcat/Km-Verhältnisse wurden verwendet, um die katalytische Effizienz der Enzyme für ihre Substrate zu vergleichen (Abb. 7). MtFAAH1 hatte die höchsten Kcat/Km-Verhältnisse für langkettige NAEs (NAE-9-HOD oder NAE18:2) oder AHLs (OdDHL oder OtDHL). Dann verringerten sich die Kcat/Km-Verhältnisse im Vergleich zu OtDHL für NAE12:0 oder Affinin um das Zwei- bis Dreifache. Die Kcat/Km-Werte für p-Cumaryl-HL oder p-Cumaryltyramin waren die niedrigsten unter allen auf MtFAAH1 getesteten Substraten (≈ 7- bis 12-fach niedriger im Vergleich zu NAE-9-HOD) (Abb. 7a, c). Im Gegensatz dazu wies MtFAAH2a die höchsten Kcat/Km-Werte für Affinin, p-Cumaryltyramin oder p-Cumaryl-HL auf. Im Vergleich zu p-Cumaryl-HL verringerte sich der Kcat/Km von MtFAAH2a für NAE12:0, OdDHL oder OtDHL um etwa das Zweifache. Bemerkenswerterweise hatte MtFAAH2a die niedrigsten Kcat/Km-Verhältnisse für NAE18:2 oder NAE-9-HOD (ca. 4- bis 9-fach niedriger als das von Affinin) (Abb. 7b, d). Diese Daten deuten darauf hin, dass MtFAAH1 unter diesen In-vitro-Bedingungen lipophile Substrate mit längeren Acyleinheiten bevorzugt, während MtFAAH2a bei Substraten mit kurzen oder aromatischen Acyleinheiten am besten abschneidet (zusammengefasst in Abb. 8).

Enzymkinetische Kurven für (a) MtFAAH1 und (b) MtFAAH2a. MtFAAHs wurden mit steigenden Konzentrationen von NAE12:0, NAE18:2, NAE-9-HOD, OtDHL, OdDHL, p-Cumaryl HL, p-Cumaryltyramin oder Affinin inkubiert. Die Reaktionen wurden in Reaktionspuffer (25 mM HEPES, 100 mM NaCl) bei pH = 9 und 0,03 % DDM für MtFAAH1 und bei pH = 7,5 und 0,06 % DDM für MtFAAH2a durchgeführt. Auf der X-Achse werden verschiedene Substratkonzentrationen (S) (5–100 µM) angezeigt. Auf der Y-Achse ist die Reaktionsgeschwindigkeit (V) als μmol produziertes Amid pro Zeiteinheit (min) pro eingesetzter Proteinmenge (mg) angegeben. Km (Michaelis- und Menten-Konstante) und V wurden in GraphPad Prism 8.0 berechnet. Das Verhältnis Kcat (Umsatzzahl)/Km bezeichnet die scheinbare Amidohydrolase-Effizienz von (c) MtFAAH1 oder (d) MtFAAH2a gegenüber einem bestimmten Substrat. Die Daten stellen Mittelwerte ± SD von dreifachen Tests dar.

Vereinfachtes Modell, das die scheinbare Amidohydrolase-Effizienz von MtFAAH1 oder MtFAAH2a gegenüber ausgewählten N-Acylamiden zeigt. Das Modell legt nahe, dass strukturelle und physikalisch-chemische Unterschiede zwischen den Substratbindungstaschen (SBPs) dieser beiden MtFAAHs, insbesondere am zytosolischen Zugangskanal (CAC) und dem Acylbindungskanal (ABC), mit der FAAH-Selektivität für ein bestimmtes Substrat zusammenhängen. Tatsächlich deuten rechnerische und biochemische Daten auf ein Szenario hin, in dem MtFAAH1 vorzugsweise lange N-Acylamide hydrolysiert, während MtFAAH2a Substrate mit entweder einer kurzen Acylkette oder einem aromatischen Schwanz besser hydrolysiert.

FAAH hydrolysiert NAE oder NAE-ähnliche Strukturen in ihre entsprechenden Amin- (Kopfgruppe) und freien Fettsäureprodukte (Schwanzgruppe)1,30,37. Kürzlich führten strukturelle und phylogenetische Vergleiche von FAAHs aus mehreren Angiospermen zur Entdeckung zweier Gruppen von FAAHs, FAAH1 und FAAH2, was auf ein komplexeres FAAH-Acylamid-Substratprofil als bisher angenommen hindeutet32. Hier wurden erstmals zwei FAAH-Isoformen aus der Hülsenfrucht Medicago truncatula auf struktureller (vorhergesagter) und funktioneller Ebene verglichen und dabei überraschende Ergebnisse erzielt. Obwohl beide Isoformen eine Reihe von Acylamidsubstraten hydrolysieren, tun sie dies mit entgegengesetzter Effizienz, was darauf hindeutet, dass eine evolutionäre Konsequenz der Entwicklung von FAAHs in Angiospermen darin besteht, die Palette der Acylamidsubstrate zu erweitern, die von diesen Enzymen genutzt werden können. Diese Unterschiede werden erst jetzt deutlich, wenn man FAAH-Isoformen betrachtet, die außerhalb der Brassicaceae32 verbreitet sind, wo nur ein FAAH (FAAH1) vorkommt und wo die meisten molekularen und biochemischen Studien durchgeführt wurden.

In kinetischen Vergleichen dieser FAAHs in vitro schien MtFAAH1 langkettige NAEs (z. B. NAE18:2) besser zu nutzen als kürzerkettige oder aromatische Substrate. Im Gegensatz dazu war MtFAAH2a bei der Hydrolyse langkettiger NAEs weitaus weniger effizient und hydrolysierte stattdessen kurzkettige oder aromatische Substrate (z. B. p-Cumaryl-HL) mit einer etwa zehnmal höheren Effizienz. Docking- und molekulardynamische Simulationsexperimente (MDS) mit Substraten in den SBPs dieser beiden FAAHs bestätigten diese Unterschiede im Enzymverhalten. Es wurde vorhergesagt, dass MtFAAH1 einen offeneren und weniger restriktiven SBP und einen flexibleren Membranzugangskanal (MAC) aufweist, der langkettige NAEs (z. B. NAE18:2) besser aufnehmen würde. Im Gegensatz dazu war das SBP von MtFAAH2a mit gebundenem NAE18:2 anders geformt und führte zu einer stärker komprimierten Ausrichtung der längeren Acylkette und einem unveränderten geschlossenen MAC. In ähnlicher Weise hydrolysierte rekombinantes AtFAAH (ein FAAH1) eine Reihe von NAEs und AHLs in einer Weise, die von der Länge der Acylkette und nicht von der polaren Kopfgruppe abhing22. Tatsächlich wurde an anderer Stelle gezeigt, dass die AtFAAH-Aktivität bei langkettigen AHLs (z. B. OdDHL oder OtDHL) am höchsten und bei kürzeren AHLs (z. B. OHHL oder OOHL) am niedrigsten war22. In ähnlicher Weise beobachteten wir, dass MtFAAH1 OdDHL oder OtDHL deutlich besser hydrolysierte als kurzkettige oder aromatische Acylsubstrate (z. B. p-Cumaryl-HL). Andererseits wurden die kurzkettigen oder aromatischen Acylamide gut im SBP von MtFAAH2a untergebracht; In den Docking- und MDS-Experimenten mit einem Aryl-HL schienen sowohl der Lacton-Ringkopf als auch der aromatische Schwanz von p-Cumaryl-HL im SBP von MtFAAH2a besser untergebracht zu sein als in MtFAAH1, was möglicherweise teilweise auf die Anwesenheit großer Aromaten zurückzuführen ist Reste in MtFAAH2a (z. B. Tyr533, Tyr444, Trp341). Alkamide (z. B. Affinin) sind schlechte Substrate für AtFAAH20. Hier stützen kinetische Daten für MtFAAH1 eine ähnliche Schlussfolgerung, wonach MtFAAH1 langkettige NAEs effizienter hydrolysiert als Affinin. Im Gegensatz dazu zeigte MtFAAH2a im Vergleich zu NAEs die höchste katalytische Effizienz gegenüber Affinin, und es ist wahrscheinlich, dass die unpolareren Reste im zytosolischen Zugangskanal von MtFAAH2a zur Unterstützung der Wechselwirkung mit Alkamiden beitrugen. Insgesamt scheint es, dass die strukturellen Unterschiede zwischen den SBPs von MtFAAH1 und MtFAAH2a und ihre vorhergesagten Wechselwirkungen mit Substraten insgesamt mit den beobachteten Unterschieden in der Hydrolyseeffizienz übereinstimmten (Abb. 6). Bemerkenswerterweise war das Quorum-Sensing-Molekül p-Cumaryl-HL38 ein effizientes Substrat für MtFAAH2a. Es ist verlockend zu spekulieren, dass M. truncatula eine FAAH2-Maschinerie entwickelt hat, die den chemischen „Kommunikationsbereich“ der Pflanzen für mikrobielle Interaktionen erweitert. Obwohl die biologischen Auswirkungen der p-Cumaryl-HL-Hydrolyse durch MtFAAH2a den Rahmen dieser Studie sprengen, liefern unsere Ergebnisse interessante Ideen zum Testen der potenziellen Funktion(en) von MtFAAH2a in Pflanzen.

Die beobachtete Divergenz in den Substratpräferenzen zwischen den beiden Medicago-FAAH-Isoformen erinnert ein wenig an das Konzept bei plazentaren Säugetieren, wo zwei divergierende FAAH-Isoformen vorhanden sind. Beim Menschen zeigten die Hydrolyseraten von zwei verschiedenen FAAHs (≈ 20 % Identität) einige unterschiedliche und überlappende Präferenzen gegenüber verschiedenen Substraten39. In dieser Studie war ein FAAH1 weitaus effizienter bei der Hydrolyse mehrfach ungesättigter Substrate (z. B. NAE20:4), während FAAH2 einfach ungesättigte Acylamide (z. B. Oleamid) bevorzugte. Im selben Bericht; FAAH1 war in der Lage, das mit der Aminosäure konjugierte Acylamid N-Oleoyltaurin (NAT) zu verarbeiten, wohingegen FAAH2 dieses Substrat nicht nutzen konnte. Interessanterweise hydrolysierten beide FAAHs NAE18:139 auf ähnliche Weise. Zumindest für Säugetier-FAAH1 wird berichtet, dass die Substratbindung im aktiven Zentrum durch zwei aromatische Aminosäurereste beeinflusst wird, die ein „dynamisches Paddel“ bilden, und dies könnte zur Substratselektivität beitragen1,6. Eine dritte Art von Amidhydrolase bei Säugetieren hat eine sehr strenge Substratpräferenz. Bei Kaninchen (Oryctolagus cuniculus) wurde gezeigt, dass eine Cysteinhydrolase, die als N-Acylethanolaminsäureamidase (NAAA) bezeichnet wird, eine deutliche Präferenz gegenüber NAE16:0 aufweist, und dies scheint von der Art ihres SBP abhängig zu sein. Tatsächlich scheint es, dass NAAA im Laufe der Evolution ein restriktiv geformtes SBP erhalten hat, das für NAE16:0 optimal ist und gegenüber anderen Acylamiden mit längerer oder kürzerer Acylkette weniger effizient ist40. Ähnlich wie Säugetiere hat die Hülsenfrucht M. truncatula möglicherweise FAAH-Isoformen entwickelt, die eine Reihe von Acylamidsubstraten selektiv verarbeiten.

Biochemische Eigenschaften dessen, was heute als FAAHs der Gruppe 1 gilt, wurden bereits früher aus Arabidopsis1,41, Reis42, Medicago truncatula42 und einem Moos (P. patens)9 charakterisiert, obwohl nicht alle Studien mit gereinigten Enzymen und nicht alle FAAH1 durchgeführt wurden Homologe wurden mit einer breiten Palette von Acylamidsubstraten getestet. Hier werden zum ersten Mal die biochemischen Eigenschaften eines FAAH-Enzyms der Gruppe 2 beschrieben, und einige Ähnlichkeiten und Unterschiede mit FAAH-Isoformen der Gruppe 1 wurden im Fortschritt der Reinigung und in den Tests der enzymatischen Aktivität festgestellt. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Unterschieden in den offensichtlichen Substratpräferenzen unterschieden sich auch andere Merkmale der Enzyme. Der isoelektrische Punkt von MtFAAH2a ist deutlich höher als der von MtFAAH1 (oder anderen FAAH1-Proteinen), was veränderte Bedingungen für die Löslichkeit im Verlauf der Reinigung erforderte (und wahrscheinlich auch das pH-Optimum für Tests in vitro beeinflusste). Die Berücksichtigung des pH-Werts des Puffers im Verhältnis zum isoelektrischen Punkt des Proteins ist wichtig für die Reinigung rekombinanter Proteine, wie an anderer Stelle berichtet43. Darüber hinaus erforderte MtFAAH2 im Vergleich zu MtFAAH1 die doppelte DDM-Konzentration, um die Solubilisierung während des Reinigungsfortschritts aufrechtzuerhalten. Trotz dieser Unterschiede wurden sowohl MtFAAH1 als auch MtFAAH2a nahezu homogen gereinigt und schienen sich aufgrund ihrer Migration im Vergleich zu bekannten Standards in SEC beide als homomere Tetramere aufzulösen. Insgesamt werden die hier identifizierten Faktoren zukünftige Studien zu FAAH-Enzymen in anderen Pflanzenarten erleichtern.

Unsere Daten stützten durchweg die Annahme, dass sowohl MtFAAH1 als auch MtFAAH2a als tetramere Oligomere gefunden werden können, wenn sie in Lösung mit Detergenz gereinigt werden, während AtFAAH als Dimer solubilisiert wurde. Frühere Berichte unterstützen oligomere Zustände für FAAHs mehrerer Organismen. Beispielsweise deutete die Kristallstruktur von FAAH aus Arabidopsis oder dem Pilz Candida albicans auf Dimere1,44 hin. Bemerkenswert ist, dass Ratten-FAAH bei Reinigung in Lösung ebenfalls als Dimer vorliegt, in Abwesenheit von Detergens jedoch drei Oktamere von Dimeren bilden kann45. Die offensichtlichen Größenunterschiede der hier aus Medicago truncatula gereinigten Apoenzyme (anders als die einzige andere Pflanze FAAH, AtFAAH, für die es eine Struktur gibt) sind faszinierend und könnten wichtige funktionelle Auswirkungen haben, aber die Quartärstruktur und ihre funktionelle Relevanz müssen in Zukunft auf sich warten lassen Studien. Darüber hinaus bleibt abzuwarten, ob diese vorhergesagte tetramere Organisation ein Merkmal von FAAH-Isoformen anderer Pflanzenarten außerhalb der Brassicaceae ist.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass MtFAAHs eine Vielzahl von NAEs, Acyl-HLs, Aryl-HLs, Alkamiden oder Phenolamiden unterschiedlich hydrolysieren. Solche Ergebnisse fallen mit Unterschieden zwischen der vorhergesagten strukturellen Organisation der SBPs von MtFAAH1 und MtFAAH2a zusammen. Obwohl wir in unseren Untersuchungen die In-vitro-Fähigkeiten von MtFAAHs gegen Substrate untersucht haben, von denen berichtet wird, dass sie entweder endogen in Pflanzengeweben (z. B. NAEs) oder in Bakterien (z. B. AHLs) akkumuliert werden, ist es möglich, dass weitere lipophile Substrate mit physiologischer Relevanz noch entdeckt werden müssen . Weitere Studien auf genetischer und physiologischer Ebene werden dazu beitragen, die Funktion zusätzlicher FAAH-Isoformen in Medicago truncatula aufzuklären. Darüber hinaus sind zusätzliche Untersuchungen von FAAH-Isoformen in anderen Pflanzenarten erforderlich, um die umfassendere Bedeutung der FAAH-vermittelten Acylamidhydrolyse in Pflanzen zu bestimmen. Dennoch bietet diese Studie eine Grundlage für zukünftige Arbeiten zur Aufdeckung potenzieller physiologischer Bedeutung und möglicher biotechnologischer Anwendungen.

Die für Abb. 1a verwendeten Hülsenfruchtsequenzen wurden aus der NCBI-Datenbank abgerufen (Ergänzungstabelle S1). Die phylogenetische Analyse wurde mit dem Online-Tool „Phylogeny.fr“ mit Standardeinstellungen46 durchgeführt. Der Sequenzabgleich wurde in Clustal Omega47 durchgeführt (Ergänzende Abbildungen S1, S7). MtFAAH1- und MtFAAH2a-Homologiemodelle wurden mit Arabidopsis FAAH als Vorlage (AtFAAH; 6DHV) in SWISS-MODEL48 erstellt. 3D-Modelle wurden in Pymol49 und BIOVIA Discovery Studio Visualizer50 visualisiert. Rückstände, die Membranbindungskappen (MBC), Membranzugangskanäle (MAC), Helixregionen (die vermutlich an der Unterbringung des Acylamidschwanzes beteiligt sind) und Substratbindungstaschenstrukturen (SBP) für MtFAAHs umfassen, wurden anhand von Details in der AtFAAH-Struktur1 vorhergesagt ( Abb. 4, 5; Ergänzungstabelle S5, S6). Antheprot3D wurde zur Vorhersage des Sekundärstrukturinhalts (ergänzende Abbildung S5) verwendet. Zu den Qualitätsparametern für die in SWISS-MODEL generierten MtFAAH-Modelle gehören: GMQE-Scores (Global Model Quality Estimate), QMEANDisCo-Scores (Qmean Consensus-based Distance Constraint) sowie Ramachandran-Diagramme und -Scores (Ergänzende Abbildungen S3, S4; Ergänzende Tabelle S3, S4).

Die Expressionsprofile von MtFAAH1, MtFAAH2a und MtFAAH2b wurden aus dem Medicago truncatula Gene Expression Atlas „MtExpress“34 abgerufen. Die entsprechenden MtFAAH-Sequenzen (Zugangsnummern siehe Ergänzungstabelle S1) wurden als Eingabe in das im Atlas integrierte BLAST-Tool verwendet.

Die Topologien der Apo-Formen von MtFAAH1 und MtFAAH2a wurden mit dem Amber-Kraftfeld (ff19SB)52 durchgeführt. Um die Apo-MtFAAH-Isoformen wurde ein kubischer Kasten von 12 Å konstruiert, und die Systeme wurden in TIP3P-Wasser solvatisiert53. Die Neutralisierung der Ladungen erfolgte durch Na+- und Cl--Ionen in einer Konzentration von 0,15 M. Das System wurde einer Energieminimierung bei einer Temperatur von 298 K und einem Druck von einem bar unterzogen. Anschließend wurden die Systeme 5 ns lang mit einer Kraftkonstante von 500 kJ/mol äquilibriert. Molekulardynamische Simulationen (MDS) wurden in der an anderer Stelle entwickelten Cloud-basierten Molekularsimulationsumgebung durchgeführt54. Diese Pipeline nutzt das Open MM Toolkit55, um Ensembles mit konstanter Temperatur und konstantem Druck (NPT) zu generieren. Die MD-Umgebung hatte eine Temperatur von 298 K und einen Druck von einem Bar. Die GPU- und Computereinheiten in Google Collab wurden verwendet, um 100-ns-Simulationen für beide MtFAAHs auszuführen. Es dauerte 12 bis 13 Stunden, bis jede Simulation abgeschlossen war. RMSD- und RMSF-Trajektorien wurden mit den Toolkits MDAnalysis56 oder PyTraj57 generiert und dann in Excel 2021 weiterverarbeitet (ergänzende Abbildung S8).

Alle 2D-Strukturen wurden mit der Software ChemDraw (Molecular Editor) gezeichnet. Substrate und Enzyme wurden wie folgt hergestellt; Die SDF-Dateien von NAE18:2 (CID: 5.283.446), NAE12:0 (CID: 8899) oder p-Cumaryl-HL (CID: 71.311.837) wurden von PubChem abgerufen. Anschließend wurde Babel 3.0.158 verwendet, um die SDF-Dateien in das PDB-Format zu konvertieren. Die PDB-Dateien der Apo-MtFAAH-Strukturen, die nach MDS von 100 ns erzeugt wurden (siehe oben), wurden für Docking-Experimente vor der Entfernung von Wasser-, Na+- und Cl--Ionen verwendet. Wasserstoff wurde zu Substraten und MtFAAH1- oder MtFAAH2a-Proteinmodellen in Pymol49 hinzugefügt. Die Energieminimierung wurde in PyRx59 mit Standardeinstellungen durchgeführt.

Das Andocken in der Software GOLD 3.0.160 konzentrierte sich auf die kovalente Bindung zwischen den Seitenkettensauerstoffatomen (Oγ) der katalytischen Reste von MtFAAH1 (Ser304; Atomnummer 4628) oder MtFAAH2a (Ser311; Atomnummer 4678) und dem Kohlenstoff des Carbonyls von NAE18:2, NAE12:0 oder p-Cumaryl-HL. Die Hohlraumerkennung wurde auf einen Radius von 20 Å um das aktive Zentrum eingestellt. In den Einschränkungseinstellungen wurden Federkonstanten zwischen 50 und 500 sowie minimale (1,30 Å) und maximale (1,60 Å) Abstände verwendet. Die Temperparameter für Van-der-Waals- und Wasserstoffbrückenbindungen wurden auf 6 bzw. 3 Å eingestellt. Der Algorithmus wurde mit externen und internen Energiewerten von 1,4 bzw. 1,0 eingestellt. Die vorhergesagten Posen wurden auf der Grundlage des Fitness-GOLD-Scores bewertet. Die Pose mit der höchsten Punktzahl wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Alle in dieser Studie ausgewählten Posen hatten GOLD-Werte über 10. Docking-Vorhersagen wurden in Pymol49 und BIOVIA Discovery Studio Visualizer50 visualisiert. Mutmaßliche Wechselwirkungen wie Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophobe Wechselwirkungen wurden im Protein-Ligand Interaction Profiler (PLIP)-Server vorhergesagt61.

Die Topologien von Proteinen (MtFAAH1 oder MtFAAH2a) und Liganden (NAE18:2 oder p-Cumaryl-HL) wurden mit den Amber-Kraftfeldern ff19SB55 bzw. GAFF262 erzeugt. Um die Protein-Ligand-Komplexe wurde ein kubischer Kasten von 15 Å konstruiert, dann wurden die Systeme in TIP3P-Wasser solvatisiert53. Die Neutralisierung der Ladungen erfolgte durch Na+- und Cl--Ionen in einer Konzentration von 0,15 M. Das System wurde einer Energieminimierung bei einer Temperatur von 298 K und einem Druck von einem bar unterzogen. Die Systeme wurden mit einer Kraftkonstante von 1600 kJ/mol während 5 ns äquilibriert. MDS-Experimente wurden in der an anderer Stelle entwickelten Cloud-basierten Molekularsimulationspipeline durchgeführt54. Für die MD-Produktion wurden die gleichen Temperaturen und Drücke wie für die Äquilibrierung verwendet. Die GPU- und Computereinheiten in Google Collab wurden verwendet, um 100-ns-Simulationen für alle MtFAAH-Ligand-Komplexe durchzuführen. Es dauerte 12–13 Stunden, bis jede Simulation abgeschlossen war. Die Flugbahnen und Protokolldateien wurden alle 100 ps aufgezeichnet. Um außerdem die kovalente Bindungswechselwirkung zwischen den Seitenkettensauerstoffatomen (Oγ) der katalytischen Reste von MtFAAHs und dem Kohlenstoff der Carbonylgruppe der Liganden nachzuahmen, haben wir unter dem MonteCarloBarostat-Tool in der Pipeline eine harmonische Beschränkung zwischen diesen Atomen hinzugefügt. Lass es regnen“54. RMSD- und RMSF-Trajektorien wurden mit den Toolkits MDAnalysis56 oder PyTraj57 generiert und dann in Excel 2021 verarbeitet (ergänzende Abbildung S10). Die Kreuzkorrelationsanalyse von Pearson wurde in derselben Pipeline erstellt54 (ergänzende Abbildung S11). Die äquilibrierten Komplexe (Zeit = 0 ns) und die MD-verarbeiteten Komplexe bei 10 ns und 100 ns wurden in Pymol49 verarbeitet, indem Wasser sowie Na+- und Cl--Ionen aus ihren Strukturen entfernt wurden (Abb. 4 und 5). Die PDB-Dateien und DCD-Trajektorien der MtFAAH-Ligand-Komplexe wurden zur Analyse der MD-Simulation in die VMD-Software63 geladen. VideoMach64 wurde mit VMD gekoppelt, um die Videos zu MDS-Experimenten zu generieren (Ergänzungsvideos S1–S12).

Das Qiagen RNeasy Plant Mini Kit wurde für die RNA-Extraktion aus Stängeln von 21 Tage alten Medicago truncatula Gaertner-Sämlingen (Wildtyp-Genotyp Jemalong A17) verwendet. M. truncatula (A17)-Samen waren ein Geschenk von Dr. Rebecca Dickstein von der University of North Texas (UNT), wie berichtet und an anderer Stelle verwendet65. Für die RNA-Extraktion verwendete Sämlinge wurden in beleuchteten Kammern gezüchtet und ihre Verwendung entsprach internationalen, nationalen und/oder institutionellen Richtlinien. Die cDNA-Synthese wurde mit dem Applied Biosystems High Capacity cDNA Reverse Transcription Thermo Fisher Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zwei PCR-Runden (nested PCR) waren erforderlich, um die kodierende Sequenz (CDS) voller Länge von MtFAAH1 zu erhalten (ergänzende Abbildung S12). Das Stoppcodon von MtFAAH1 wurde mit spezifischen Primern aus seinem CDS entfernt (Ergänzungstabelle S8). Für die High-Fidelity-PCR wurde Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England BioLabs) verwendet. Zur Schätzung der PCR-Produktgröße wurde die 1-Kb-MassRuler-DNA-Leiter (Thermo Fisher) verwendet. Die Insertion von MtFAAH1 CDS in das pTrcHIS2-Plasmid (Invitrogen) wurde durch TA-Klonierung gemäß den Anweisungen des Herstellers erreicht.

Das CDS von MtFAAH2a wurde von GENEWIZ synthetisiert und in den pUC57-Amp-Vektor eingefügt. Anschließend wurden spezifische Primer (Ergänzungstabelle S8) zur Entfernung des Stoppcodons und zur Subklonierung in das pTrcHIS2-Plasmid (Invitrogen) (Ergänzungstabelle S12) verwendet, wie oben beschrieben. Alle Vektoren wurden vor der heterologen Expression durch DNA-Sequenzierung als korrekt bestätigt.

Rekombinantes MtFAAH1 wurde in E. coli BL21 (DE3)-Zellen aus dem pTrcHIS2-Plasmid (Invitrogen) mit C-terminalen c-myc- und Histidin-Tags (6X) hergestellt. Übernachtkulturen wurden mit 100 µg/ml Ampicillin (GoldBio) bei 37 °C gezüchtet und in frisches LB mit 100 µg/ml Ampicillin geimpft und bei 37 °C gezüchtet, bis die OD600 0,5–1,0 erreichte. Die Proteinproduktion wurde mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (GoldBio) 18 Stunden lang bei 16 °C induziert. Die Zellen wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4000 Xg bei 4 °C geerntet und dann über Nacht bei –80 °C eingefroren. Nach dem Auftauen in Lysepuffer (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 % (v/v) Triton X-100), 1 mM EDTA, 1 µM E-64, 1 µM Pepstatin, 1 mg/ml Lysozym (Sigma ) und 25 Einheiten/ml Benzonase-Nuklease (Sigma) wurden alle hinzugefügt. Das Zellpellet wurde durch Rotation bei 30 U/min für 30 Minuten bei 4 °C suspendiert und dann 8 Minuten lang mit Ultraschall (Ultraschallprozessor GEX 130) bei 20 % Intensität mit 30 Sekunden Einschaltimpulsen und 30 Sekunden Ausschaltimpulsen behandelt. Zelltrümmer wurden bei 14.000 Xg 30 Minuten lang bei 4 °C pelletiert und das Lysat mit Ni-NTA-Agaroseharz (Qiagen) inkubiert und durch Rotation bei 30 U/min 1 Stunde lang bei 4 °C suspendiert. Nachdem das Zelllysat mithilfe einer Schwerkraftflusssäule vollständig vom Harz getrennt worden war, wurde das Harz mit zwei Puffern gewaschen: (1) 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 10 mM Imidazol; (2) 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 0,03 % (w/v) Dodecyl-beta-D-maltosid (DDM), 25 mM Imidazol. Das His-markierte, rekombinante Protein wurde dann mit 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 0,03 % DDM, 250 mM Imidazol, 1 mM EDTA, 1 µM E-64, 1 µM Pepstatin vom Harz eluiert. DTT (1 mM) wurde frisch zur eluierten Fraktion gegeben und über Nacht bei 4 °C gelagert. Am nächsten Tag wurde die eluierte Fraktion konzentriert und unter Verwendung eines 30.000 MWCO-Zentrifugalfiltergeräts (Sartorius) gegen 50 mM Bis-Tris-Propan, pH 9,0, 100 mM NaCl, 0,03 % DDM ausgetauscht. Rekombinantes Protein wurde unter Verwendung einer Superdex 200-Erhöhungssäule 10/300 GL (Cytiva) auf einem AKTA Pure-System (Cytiva) weiter gereinigt und fraktioniert. SEC-eluierte Fraktionen wurden bei einer UV-Absorption von 280 nm beobachtet, fraktioniert und für SDS-PAGE-Analyse, LC/MS/MS oder Enzymaktivitätstests gesammelt.

Rekombinantes MtFAAH2a wurde mit den gleichen Methoden wie MtFAAH1 (siehe oben) gereinigt, mit Ausnahme des Puffer-pH-Werts und der Detergenskonzentration. Für MtFAAH2a hatten alle Puffer während des Reinigungsprozesses einen pH-Wert von 7,5 und 0,06 % DDM. SEC-Fraktionen wurden für SDS-PAGE-Analyse, LC/MS/MS und Enzymaktivitätstests gesammelt.

Die Gelbänder wurden mit 100 % Acetonitril dehydriert und mit 10 mM Dithiothreitol in 100 mM Ammoniumbicarbonat, pH ≈ 8, 45 Minuten bei 56 °C inkubiert, erneut dehydriert und im Dunkeln mit 50 mM Iodacetamid in 100 mM Ammoniumbicarbonat 20 Minuten lang inkubiert Mindest. Anschließend wurden die Gelbänder mit 100 mM Ammoniumbicarbonat gewaschen und erneut dehydriert. Modifiziertes Trypsin, Chymotrypsin und Asp-N in Sequenzierungsqualität wurden auf 0,01 µg/µL in 50 mM Ammoniumbicarbonat zubereitet und ≈ 50 µL davon wurden zu jeder Gelbande hinzugefügt, so dass das Gel vollständig eingetaucht war. Anschließend wurden die Banden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Peptide wurden aus dem Gel durch Wasserbadbeschallung in einer Lösung aus 60 % Acetonitril/1 % TCA extrahiert und im Vakuum auf ca. 2 µL getrocknet.

Anschließend wurden die Peptide in 2 % Acetonitril/0,1 % TFA auf 20 µl resuspendiert. Davon wurden 5 µL automatisch durch EASYnLC 1000 auf eine Thermo Acclaim PepMap 0,1 mm × 20 mm C18-Peptidfalle injiziert und etwa 5 Minuten lang gewaschen. Die gebundenen Peptide wurden dann über 35 Minuten auf einer Thermo Acclaim PepMap RSLC 0,075 mm × 250 mm C18-Säule mit einem Gradienten von 5 % B bis 38 % B in 24 Minuten eluiert, der nach 25 Minuten auf 90 % B anstieg und bei 90 % B gehalten wurde für die Dauer des Laufs bei einer konstanten Flussrate von 0,3 µL/min (Puffer A = 99,9 % Wasser/0,1 % Ameisensäure, Puffer B = 99,9 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure). Die Säule wurde mithilfe einer integrierten Säulenheizung (PRSO-V1, Sonation GmbH, Biberach, Deutschland) auf 50 °C gehalten.

Eluierte Peptide wurden mithilfe einer Flex Spray-Sprühionenquelle in ein ThermoFisher Q-Exactive-Massenspektrometer gesprüht. Im Orbitrap wurden Vermessungsscans durchgeführt (Auflösung 70.000, bestimmt bei m/z 200) und die obersten 15 Ionen in jedem Vermessungsscan wurden dann einer automatischen kollisionsinduzierten Dissoziation (HCD) mit höherer Energie unterzogen, wobei Fragmentspektren mit einer Auflösung von 17.500 erfasst wurden. Die resultierenden MS/MS-Spektren wurden mit Mascot Distiller, v2.8.0.1 (www.matrixscience.com) in Peaklisten umgewandelt und mit einer Datenbank abgeglichen, die FAAH-Proteinsequenzen und E. coli-Proteinsequenzen von Uniprot (www.matrixscience.com) enthielt. uniprot.org) mit häufigen Laborkontaminanten (heruntergeladen von www.thegpm.org, cRAP-Projekt) unter Verwendung des Mascot-Suchalgorithmus, Version 2.7.1. Die Mascot-Ausgabe wurde dann mit Scaffold, v5.0.1 (www.proteomesoftware.com) analysiert, um Proteinidentifizierungen probabilistisch zu validieren. Mit dem Scaffold 1 % FDR-Konfidenzfilter validierte Zuweisungen gelten als wahr. Die massenspektrometrischen Proteomikdaten wurden über das Partnerrepository PRIDE67,68 mit der Datensatzkennung PXD038494 und https://doi.org/10.6019/PXD038494 beim ProteomeXchange Consortium66 hinterlegt.

Standardkurven wurden erstellt, indem der Verteilungskoeffizient (Kav) gegen den Logarithmus der Molekulargewichte bekannter Standards (Thyroglobulin, γ-Globulin, Ovalbumin, Myoglobin und Vitamin B12, Bio-Rad; Apoferritin, Sigma) gemäß dem Cytiva SEC-Handbuch aufgetragen wurde , Anhang 6. Zwei separate Standards und Standardkurven wurden in Bezug auf die unterschiedlichen Bedingungen zur Reinigung der MtFAAHs erstellt. Anschließend wurde der Kav jedes FAAH anhand des durchschnittlichen Elutionsvolumens des Peaks aus sechs an verschiedenen Tagen durchgeführten Reinigungen berechnet. Nachdem wir diesen Wert auf die entsprechende Kurve interpoliert hatten, berechneten wir das Molekulargewicht und schätzten die Oligomerisierungszustände unter Berücksichtigung der Detergensaggregationszahl35. Berechnungen wurden in GraphPad Prism 8.0 durchgeführt.

Während der Reinigung entnommene Proben wurden mit dem BCA Rapid Gold Assay (Thermo) quantifiziert und in einem vorbereiteten 10 %igen Auflösungsgel durch SDS-PAGE (Bio-Rad) aufgetrennt. Zehn Mikrogramm Zelllysat, pelletierte Zelltrümmer und Durchfluss wurden zusammen mit 2 µg des Nickelaffinitäts-gereinigten Proteins und 2 µg des SEC-gereinigten Proteins einer SDS-PAGE unterzogen. Die Proben wurden in 4 × Laemmili-Puffer (Bio-Rad) mit 10 % (v/v) β-Mercaptoethanol denaturiert und die Elektrophorese wurde 50 Minuten lang bei 175 konstanten Volt durchgeführt. Anschließend wurden die Gele gemäß dem Protokoll des Herstellers mit QC Colloidal Coomassie Blue (Bio-Rad) gefärbt (Abb. 6b, d; ergänzende Abbildungen S14–S16, S19, S20, S24–26). Alternativ wurden in den Experimenten fleckenfreie BIO-RAD-Gele verwendet (Ergänzende Abbildungen S13, S21 – S23). Molekulargewichte (MW) und isoelektrische Punkte (pI) der Aminosäuresequenzen wurden mit dem ExPasy-Tool online berechnet (https://web.expasy.org/protparam). Ohne die Stoppcodons hatte MtFAAH1 ein MW von 66,02 kDa und einen pI von 5,83, während MtFAAH2a ein MW von 66,71 kDa und einen pI von 8,48 hatte. Die Gelbanden wurden analysiert und mit bekannten Standards (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad) in Bezug auf die berechneten Molekulargewichte der FAAHs verglichen. Unbeschnittene/unbearbeitete SDS-PAGE-Gele, die für Abb. 6b, d verwendet wurden, finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. S19 bzw. S20. Die unbeschnittenen/unbearbeiteten SDS-PAGE-Gele, die für die ergänzende Abbildung S13 verwendet wurden, sind in den ergänzenden Abbildungen zu finden. S21–S23, während die Originalgele, die für die ergänzenden Abbildungen verwendet wurden. S14–S16 finden Sie in den ergänzenden Abbildungen. S24–S26.

GCMS-basierte Enzymaktivitätstests wurden wie an anderer Stelle12 beschrieben durchgeführt, um Substrate und Reaktionsprodukte zu bestätigen, mit einigen Modifikationen. Kurz gesagt, Reaktionspuffer 1 (50 mM Bis-Tris-Propan; pH = 9,0; 0,03 % DDM) oder Reaktionspuffer 2 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl; pH = 7,5; 0,06 % DDM) wurden mit 100 µM ( Endkonzentration verdünnt aus 10 mM Stammlösung in DMSO) von NAE12:0. Dann wurden 5 μg rekombinantes MtFAAH1 oder MtFAAH2a in die Reaktionsmischungen 1 bzw. 2 gegeben. Als Positivkontrolle wurden Reaktionen mit 1 μg AtFAAH in Reaktionsmischung 1 einbezogen. Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei 30 °C unter Schütteln (120 U/min) inkubiert. Als Negativkontrollen wurden Parallelreaktionen mit gekochtem Enzym (15–30 min bei 80–100 °C) einbezogen. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von vorgewärmtem Isopropanol (IPA) gestoppt, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 70 °C. Als nächstes wurde eine Extraktionsmethode auf Chloroformbasis durchgeführt, um die aus den Reaktionen erzeugten Lipide zu isolieren. Lipidprodukte wurden unter N2 getrocknet und zur Derivatisierung in 50 µL BSTFA resuspendiert (30 Min. bei 50 °C). Anschließend wurden die Proben unter N2 getrocknet und in 70 µL Hexan resuspendiert. Die Proben wurden mit GCMS (Modell Agilent 7693) unter den folgenden Bedingungen analysiert; gepulst-split-los (Injektionsmodus) mit einem Innendruck und einem Spülfluss von 48 (kPa) bzw. 50 (ml/min). Helium war die mobile Trägerphase. Die stationäre Phase war eine Kapillarsäule (Agilent HP-5 ms GC-Säule) mit einer Länge von 30 mm, einem Innendurchmesser von 0,25 mm und einer Filmdicke von 0,25 μM. Das GCMS wurde an das Elektronenstoß-MS-Modul (EI) angepasst und Massenspektraldaten wurden im Vollscanmodus erfasst. Reaktionsprodukte wurden als Trymethylsilyl (TMS)-Derivate identifiziert. Abschließend erfolgte die Identifizierung und Quantifizierung der Lipidspezies aus den Reaktionen durch Analyse ihrer Peakretentionszeiten, entsprechender Massenspektren, TMS-Ionendiagnosespezies und/oder NIST-Bibliothekssuche (National Institute of Standards and Technology).

Auf Fluorescamin basierende Enzymaktivitätstests wurden mit wenigen Änderungen wie an anderer Stelle entwickelt und beschrieben22,36 durchgeführt. Für die Enzymaktivitätstests bei verschiedenen pH-Bedingungen wurden rekombinantes MtFAAH1 oder MtFAAH2a (1 μg) mit 100 μM NAE12:0 in Reaktionspuffer 1 (100 mM K-Phosphat, 6 mM K2-Phosphat; pH = 6) inkubiert. Reaktionspuffer 2 (25 mM HEPES, 100 mM NaCl; pH = 7), Reaktionspuffer 3 (25 mM HEPES, 100 mM NaCl; pH = 8) oder Reaktionspuffer 4 (25 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2; pH = 9) in einer 96-Well-Mehrschichtplatte für 5–10 Minuten bei 30 °C. DDM (0,03 % oder 0,06 %) wurde jeder Reaktion mit MtFAAH1 bzw. MtFAAH2a zugesetzt. Substrate wurden aus Stammlösungen bis zu den gewünschten Endkonzentrationen zugegeben, um die Reaktionen zu starten. Als Negativkontrollen wurden Parallelreaktionen mit gekochtem Enzym (30 min bei 80–100 °C) einbezogen. In den Experimenten wurden drei unabhängige Reaktionen (Replikate) durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 20 µL Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (10 mM Stammlösung in DMSO) gestoppt. Ein Aliquot von 15 μl wurde mit 45 μl Fluorescamin (3,6 mM Stammlösung in Aceton) und 97,5 μl Milliq-Wasser in einer 96-Well-Mikrotiterplatte für fluoreszenzbasierte Tests gemischt. Reaktionsmischungen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde in einem BioTek Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader gemessen, der auf 390 nm (Anregung) und 475 nm (Emission) eingestellt war. Die Rohfluoreszenzwerte der Reaktionen wurden von den Negativkontrollwerten abgezogen. Um anschließend die Fluoreszenzwerte in µmol erzeugtes Ethanolamin umzuwandeln, wurden separat Standardkurven mit unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanolamin (Sigma-Aldrich) erstellt, das mit Fluorescamin reagierte. Enzymaktivitätstests bei fünf verschiedenen Temperaturbedingungen (20, 30, 40, 50 oder 80 °C) wurden ebenfalls wie oben beschrieben durchgeführt.

Für die Reinigungstabelle (Ergänzungstabelle S7) wurden Zelllysat, IMAC- oder SEC-gereinigte Fraktionen als Enzymquellen für Enzymaktivitätstests gegen NAE12:0 gemäß der oben angegebenen Strategie verwendet. Die Gesamtaktivität wird als Enzymeinheit (U) dargestellt und stellt die μmol Produkt (Ethanolamin) dar, die pro Zeiteinheit (Minuten) erzeugt werden. Die spezifische Aktivität wurde berechnet, indem die Gesamtaktivität durch die Menge (mg) des in den Tests verwendeten Proteins dividiert wurde. Die Ausbeute wird als Prozentwert dargestellt und stellt die Enzymaktivität dar, die nach jedem Reinigungsschritt erhalten bleibt. Die Ausbeute an IMAC- oder SEC-Fraktionen wurde berechnet, indem die Gesamtaktivität jedes dieser Schritte durch die Gesamtaktivität des rohen Zelllysats dividiert wurde. Der Reinigungsgrad wurde als Verhältnis zwischen der spezifischen Aktivität der IMAC- oder SEC-Fraktionen und der für das rohe Zelllysat berechneten spezifischen Aktivität berechnet. Der Durchschnitt der dreifachen unabhängigen Reaktionen ist in der Ergänzungstabelle S7 dargestellt.

Für die enzymkinetischen Tests wurden rekombinantes MtFAAH1 oder MtFAAH2a (1 μg) mit steigenden Konzentrationen von NAE oder NAE-ähnlichen Substraten (5–100 μM) in Reaktionspuffer (25 mM HEPES, 100 mM NaCl) bei pH = 9 und 0,03 inkubiert % DDM für MtFAAH1 und bei pH = 7,5 und 0,06 % DDM für MtFAAH2a. Das Reaktionsgemisch wurde 5–10 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Als Negativkontrollen wurden Parallelreaktionen mit gekochtem Enzym (30 min bei 100 °C) einbezogen. In den Experimenten wurden drei unabhängige Reaktionen (technische Replikate) durchgeführt. Inklusive Substrate; NAE12:0 (hausintern synthetisiert), NAE18:2 (Cayman Chemical), NAE-9-HOD (hausintern synthetisiert, wie an anderer Stelle berichtet23), OdDHL (Sigma-Aldrich), OtDHL (Sigma-Aldrich), p-Cumaryl- HL (Sigma-Aldrich), p-Cumaryltyramin (Geschenk von Dr. David Mackey) und Affinin (Geschenk von Dr. Jorge Molina Torres). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 20 µL Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (10 mM in DMSO) gestoppt. Ein Aliquot der Reaktion wurde wie oben beschrieben mit Fluorescamin und Wasser gemischt. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenz wurde wie oben beschrieben gemessen.

Um Fluoreszenzwerte in µmol produziertes Amin umzuwandeln, wurden Standardkurven mit steigenden Konzentrationen von Ethanolamin (Sigma-Aldrich) (für NAEs), Homoserinlacton (Sigma-Aldrich) (für AHLs und p-Cumaryl-HL), Tyramin (Sigma) erstellt -Aldrich) (für p-Cumaryltyramin) oder Isobutylamin (für Affinin) (Sigma-Aldrich) Standards. Offensichtliche enzymkinetische Parameter wurden in GraphPad Prism 8.0 berechnet. Angepasste Kurven hatten R2-Werte von 0,54 bis 0,94 für MtFAAH1 und von 0,78 bis 0,94 für MtFAAH2a.

Die während der aktuellen Studie generierten und analysierten Massenspektrometrie-Proteomikdaten sind über ProteomeXchange mit der Kennung PXD038494 verfügbar.

Die ursprüngliche Online-Version dieses Artikels wurde überarbeitet: Die Reihenfolge des begleitenden Ergänzungsvideos 2, Ergänzungsvideo 3, Ergänzungsvideo 4, Ergänzungsvideo 5, Ergänzungsvideo 6, Ergänzungsvideo 7, Ergänzungsvideo 8, Ergänzungsvideo 9, Ergänzungsvideo 10 , Ergänzungsvideo 11 und Ergänzungsvideo 12 wurden fälschlicherweise als Ergänzungsvideo 10, Ergänzungsvideo 11, Ergänzungsvideo 12, Ergänzungsvideo 2, Ergänzungsvideo 3, Ergänzungsvideo 4, Ergänzungsvideo 5, Ergänzungsvideo 6, Ergänzungsvideo 7, Ergänzungsvideo angegeben 8 und Ergänzungsvideo 9. Ergänzungsvideo 1 war zum Zeitpunkt der Veröffentlichung korrekt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Xiaoqiang Wang (BioDiscovery Institute, University of North Texas) für den Zugriff auf die Software GOLD 3.0.1, die für die molekularen Docking-Experimente verwendet wurde. Wir danken Dr. David Mackey (Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University) für die Bereitstellung des p-Cumaryltyramins, das in den Experimenten verwendet wurde. Wir danken Dr. Jorge Molina Torres (CINVESTAV-IPN, Irapuato, Mexiko) für die Bereitstellung des Affinins, das in den Experimenten verwendet wurde. Wir danken Douglas Whitten (Research Technology Support Facility, Michigan State University) für seine Unterstützung bei der Identifizierung rekombinanter Proteine ​​in LC/MS/MS. Diese Forschung wurde von der US National Science Foundation (IOS 2051636) unterstützt.

BioDiscovery Institute, Abteilung für Biowissenschaften, University of North Texas, Denton, TX, USA

Omar Arias-Gaguancela, Emily Herrell, Mina Aziz und Kent D. Chapman

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OAG, EH, MA und KDC haben Forschung konzipiert. MA legte Ausgangsbedingungen für die Proteinreinigung fest und gab Ratschläge zu Enzymaktivitätstests. OAG und EH führten die Experimente durch. OAG, EH und KDC analysierten die Daten. OAG und EH haben den ersten Entwurf des Manuskripts geschrieben. KDC hat das Manuskript bearbeitet. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Kent D. Chapman.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Arias-Gaguancela, O., Herrell, E., Aziz, M. et al. Zwei Isoformen der Fettsäureamidhydrolase aus Hülsenfrüchten mit unterschiedlicher Präferenz für mikrobielle und pflanzliche Acylamide. Sci Rep 13, 7486 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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Eingegangen: 22. November 2022

Angenommen: 06. Mai 2023

Veröffentlicht: 09. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34754-z

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